a)抗原形成了二聚体。增多巯基乙醇量，煮沸变性时间延长，可以打开二聚体。

b)蛋白本身的修饰 如：糖基化，磷酸化等。

DAB 有毒，但是比较灵敏，是 HRP 最敏感的底物；ECM 结果容易控制，但被催化时灵敏度差一 点，但如果达到阀值，就特别灵敏，可以检测pg 级抗原。要看你实验的情况。

a)可能是红灯造成的,胶片本来就被曝光了，可以在完全黑暗的情况下操作.看是否有改善.；

b)显影 时间过长。

如果能够排除下面的几个问题那么问题多半出现在一抗和抗原制备上。

a)二抗的HRP 活性太强，将底物消耗光； 

b)ECM 底物中H2O2，不稳定，失活； 

c)ECL 底物没覆盖到相应位置； 

d)二抗失活。

你的一抗浓度较高，二抗上 HRP 催化活力太强，同时你的显色底物处于一个临界点，反应时间不长，将周围底物催化完，形成了空白即“反亮现象”。将一抗和二抗浓度降低，或更换新底物。

减少抗原上样量，降低一抗浓度，改变一抗孵育时间，提高牛奶浓度。

可以加大抗原上样量，这是最主要的。同时也可以将一抗稀释比例降低。

可以选择 0.2μml 的膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。其他按步骤即 可。

a)可能因为你的蛋白没有变性完全，可以适当提高SDS 浓度，同时将样品煮沸时间延长 

b)也不排除你的抗原浓度过高，这时再加入适量上样缓冲液即可。

原因有很多： 

a)你的细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；

b)你的细胞中的蛋白质被降解掉了，你必需加入 PMSF，抑制蛋白酶活性；

c)你的抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，看是否有问题。

灵敏，可达ng 级，用Ecl 显色法理论上可达pg 级。方便，特异性高。