－80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被 酶水解了)。

可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有 问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试 1.5mm 的。

200kd 的蛋白不好做， 分离胶用7％，积层胶3.5％。

你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，加20％甲醇。

如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂要温和得多，这时最好加上NaF 去抑制磷酸化酶 的活性。

当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。

能，没有问题。

一般5×10^6 就足够了。

怀疑是样品问题，可能是： 

1，样品不能反复冻融； 

2，样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查WesternBlot 过程， 提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制 剂来说，一般加PMSF 就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。

①免疫组化可以用来进行定位，但是不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；Westernblot 可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量，但是不能定位。 

②两种实验的一抗有时候不能通用，公司的产品说明一般都会说明可以进行什么实验，在免疫 组化时，是否适合石蜡切片或者冰冻切片。

NaF 是一种广谱磷酸化酶的抑制剂，一般最好加。但是不加也可以，大部分时候是不用加的。

可能是：

a)样品浓度过低；

b)转移时间不够。