PVDF 膜用甲醇泡的目的是为了活化 PVDF 膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结 合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属 于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间 结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位， 那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。

对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP 标记的二抗。

抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3 次。稀释 后应在 2－3 天内使用，4 度保存，避免反复冻融。

比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。

上样量要根据实验的要求来定， 如果要求是定量和半定量的WesternBlot 则上样量要均等，如 果只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了，但是不要超载。

a)可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量；

b)用5 倍的上样缓冲液来稀释变性

做 200kd 蛋白的WesternBlot 时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心；转移时间需 要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。

必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑 制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ）。

WesternBlot 一般上样 30－100 微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和孵育 时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点 时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要 反复地试了，当然有的不适合 WesternBlot 的怎样做也不行。

不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点．

上述提到的两种凝胶均可以使用，因为105KD 的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意 条带位置。