一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。除非有文献特别指明用特殊 的方法，一般来说都没有区别。

可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很多都可以当成内参，在网上 查查就可以选出你要的内参。

一般来说，是小分子量Marker 跑走了，增加胶浓度或减少电泳时间试试看。当然梯度胶也是不错 的选择。

对于发表文章的实验最好加内参，实验严谨。

可以考虑：转移缓冲液中加入 20%甲醇（是指终浓度），因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可 增加蛋白质和NC 膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转 移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用 小孔径的NC 膜（0.2 微米）。

这么广的分布不好转移，一般建议：21kd 和66kd 可以一起转，12％SDS-PAGE，湿转 120mA，45-60min 就可以了，可以根据你实验室的经验调节；170kd 用7%SDS－PAGE， 200mA90-120min。

没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以 了；也可能母液（30%聚丙酰胺）有问题，你可以重新配制一份观察；能够替换的试剂，尽量换一 下，选用好的试剂。

无特殊要求。但我们一般是上槽放新鲜的缓冲液，下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液。

这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做 WesternBlot 和免疫组化。

一抗的稀释度是有说明的，根据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积一般最少为3－ 5ml

这是正常的，大分子的蛋白转移的慢，你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分 子的就有可能会变淡。

可以。