●膜上多处出现黑点或黑斑原因：抗体与封闭试剂发生非特异性的结合。 

●反白（条带显白色）原因：目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高。 

●蛋白分子量偏低或偏高原因：胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。

可能的原因及建议： 

●检测样本不表达目的蛋白选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。 

●检测样本低表达目的蛋白提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。 

●转移不完全或过转移可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过 头；适当调整转膜的时间和电流。 

●抗体不能识别测试种属的相关蛋白购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测 试种属的对应蛋白。 

●一抗孵育时间不足建议 4℃结合过夜。 

●二抗与一抗不匹配 选择针对一抗来源的种属的抗体。 

●洗膜过度洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂 Tween-20。

操作有毒试剂时，带手套和口罩，且操作挥发性试剂应在通风橱中进行。

可能的原因及建议： 

●目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条 带。查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。

●目的蛋白有其它剪切本查阅文献或生物信息学分析可能性。 

●样本处理过程中目的蛋白发生降解加入蛋白 酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。 

●上样量过高，太敏感适当减少上样量。 

●一抗特异性不高重新选择或制备 高特异性的抗体。 

●一抗不纯纯化抗体 

●一抗或者二抗浓度偏高降低抗体浓度。

●︶条带呈笑脸状 原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好;电泳系统温度偏高。 

●︵条带呈皱眉状原因：可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚 合不完全。 

●拖尾原因：样品溶解不好。 

●纹理（纵向条纹）原因：样品中含有不溶性颗粒。 

●条带偏斜原因：电极不平衡或者加样 位置偏斜。

●条带两边扩散原因：加样量过多。

可能的原因及建议： 

●膜封闭不够延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。 

●一抗稀释度不适宜对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。 

●一抗孵育的温度偏高，建议 4℃结合过夜。 

●选择的膜容易产生高背景，一般硝酸纤维素膜的背景会比PVDF 膜低。 

●膜在实验过程中干过实验过程中要注意保持膜的湿润。 

●检测时曝光时间过长，减少曝光时间。

小分子的蛋白在转移过程中，会透过膜去，所以大分子的上去以后，有一部分小分子的就透过去 了。

一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉 下来，结果较差。PVDF 膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合，同时也有疏水作用，但相对较弱。这 样的话，PVDF 膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。

影响跑胶跑的质量，有以下几个因素： 

（1）电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶 55v，分离胶75v 就能跑得很好。 

（2）胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释上层的分离胶.

均可在室温进行，如果时间不够，一抗孵育可以先在室温进行一个小时，然后4 度过夜。

是 Tween，配方如下:Tris-BufferedSalineTween-20(TBST),NaCl：8g，Trisbase：2.42g加水 800ml 溶解,加500-1000ul 的Tween-20,用HCl 调节 pH至7.4,加水定容至1L。

选用beta-actin 就可以。