【缺氧探针】Hypoxyprobe正确使用 FAQs

常见问题解答（FAQs）：

注：Pimonidazole：吡莫硝唑

1.问：什么是 pimonidazole HCl（Hypoxyprobe-1）的最佳溶剂？

答：pimonidazole HCl 是弱碱 pimonidazole 的盐酸盐，在水溶液中非常易溶，包括中性缓冲盐水（116 mg/mL 或 400 mmol）。这允许在动物研究中使用小体积（0.1-0.5 mL）进行腹腔内或静脉注射 pimonidazole HCl。

2.问：用于缺氧标记的 pimonidazole HCl 剂量应该是多少？

答：pimonidazole HCl 在缺氧组织中的结合程度将取决于生物还原激活的速率以及组织对 pimonidazole HCl 的接触程度（接触 = 浓度 x 时间）。还原代谢的速率很难预测，但可以检查接触的影响。在以下计算中，浓度以 pimonidazole HCl（分子量 290.7）为单位给出。

体外接触于 58mg/kg（培养基中的浓度）1 小时的球状体观察到强烈的缺氧染色。接触 = 58mg/kg x 1 小时 = 58mg/kg-小时。

在人体中，使用 0.5gm/m²（约 14mg/kg）的剂量可以获得肿瘤组织和正常上皮中的强染色，其中 pimonidazole 的血浆半衰期为 5 小时。接触 = 14 mg/kg x 5 小时 = 70 mg/kg-小时。

在小鼠肿瘤组织中，使用 60 mg/kg 可以获得缺氧的强染色，其中 pimonidazole 的血浆半衰期为 0.25 小时。接触 = 60mg/kg x 0.25 小时 = 15 mg/kg-小时。

总结来说，对于体型统一的小动物，如实验室大鼠和小鼠，推荐使用 60 mg/kg 体重的 pimonidazole HCl 剂量，这是效果和经济性之间的良好平衡。在小鼠和大鼠中使用了 30 mg/kg 至 400 mg/kg 的剂量，没有毒性或由于血流效应导致的氧气水平改变，但使用超过 100 mg/kg 的 pimonidazole 剂量时，观察到在小鼠后腿植入的肿瘤中出现血流效应。因此，在使用后腿肿瘤模型时，剂量 > 100 mg/kg 必须小心。对于体型不均匀的较大动物，剂量通常基于表面积计算。对于人类，推荐剂量为 0.5 gm/m2，而狗的使用剂量为 0.28 gm/m2。

3.问：Hypoxyprobe-1 是否能穿透缺氧的大脑和脑肿瘤组织？

答：尽管 Hypoxyprobe-1 是水溶性的，但其相应的游离碱（pimoindazole）具有 8.5 的辛醇-水分配系数，因此该标记物可以自由穿透大脑和脑肿瘤组织。

大鼠脑肿瘤冰冻切片的免疫荧光染色。大鼠脑肿瘤冰冻切片的免疫荧光染色。血管：ME 9F1；红色。缺氧：Pimonidazole 加合物；绿色。灌注：Hoechst 33342；蓝色。正常大脑（N）和肿瘤组织（T）。原始放大倍数为 x 200。注意正常大脑中血管的规则模式与肿瘤组织中血管的无序排列（Bernsen et al, Journal of Neurosurgery 93: 449-454, 2000; by permission）。

4.问：pimonidazole HCl 是检测体内缺氧的最佳探针吗？

答：pimonidazole HCl，即“金标准”免疫组化缺氧标记物，具有真正的优势，包括高水溶性（在盐水中为 116 mg/mL），允许以小体积注射 ip 或 iv 给药。像六氟化 CCI-103F 这样的标记物水溶性为 10 毫摩尔或更低，通常作为 ip 花生油和 DMSO 的乳液给药，以避免血液稀释。

固体 pimonidazole HCl 在室温或 4°C 下非常稳定（多年）。在 4°C 下避光保存的 pimonidazole HCl 浓缩水溶液也非常稳定（多年）。小鼠和兔子对 pimonidazole 加合物的抗体在 4°C 下保存至少一年稳定。

小鼠中 pimonidazole 的 LD50(7天) 为 728 mg/kg，将其归类为低毒性的非危险品。

尽管 pimonidazole HCl 非常水溶性，但作为游离碱的 pimonidazole 具有 8.5 的高辛醇-水分配系数，并且容易穿透所有组织，包括大脑。实际上，它在大多数组织中的积累比血浆水平高 3 倍，使其有效的组织浓度远高于其他 2-硝基咪唑缺氧标记物。

Pimonidazole 的结合可以通过多种技术检测，包括：冷冻固定组织切片中的免疫荧光；福尔马林固定石蜡包埋组织切片中的免疫过氧化物酶染色；ELISA；或流式细胞术。

5.问：单克隆抗体对 pimonidazole 加合物是否可以用于小鼠组织？

答：是的。对于福尔马林固定石蜡包埋的组织，我们推荐使用过氧化物酶 F(ab)2 二级抗体策略（见产品手册），它提供了非常干净的背景，适用于多种动物物种。

6.问：pimonidazole HCl 激活和结合到缺氧细胞的机制是什么？

答：Varghese et al.表明，缺氧细胞将 2-硝基咪唑结合到肽硫醇，如谷胱甘肽。目前对 pimonidazole 代谢的看法总结在下面的方案中。O₂ 与 pimonidazole 的第一个电子的添加竞争，这解释了激活和结合的 pO2 依赖性。根据试管实验，估计大约 20% 的活化 pimonidazole 结合到细胞硫醇上，大约 80% 不结合但通过与水的反应而断裂。Pimonidazole 受氧化代谢的影响，导致容易排泄的 N-氧化物、硫酸盐和葡萄糖醛酸衍生物（ST = 硫酸转移酶；GT = 葡萄糖醛酸转移酶）。这些氧化途径似乎不影响 pimonidazole 作为缺氧标记物的效用。

7.问：Hypoxyprobe 试剂盒中提供的 IgG1 抗体浓度是多少？

答：Hypoxyprobe-1 试剂盒中提供的耗尽杂交瘤溶液中小鼠 IgG1 单克隆抗体的浓度约为 60 ug/mL。

Hypoxyprobe-1 Plus 试剂盒中的 FITC 偶联 MAb；Hypoxprobe-1 Green 试剂盒；Hypoxyprobe-1 Red549 试剂盒；Hypoxyprobe-1 RedAPC 试剂盒；和 Hypoxyprobe-1 Biotin 试剂盒中的亲和纯化 IgG1 的浓度约为 500 ug/mL。

亲和纯化的兔子抗血清对 pimonidazole 加合物和未纯化的兔子抗血清对 Hypoxyprobe-F6（CCI-103F）加合物中的活性 IgG 分子的浓度未知。

8.问：pimonidazole 结合是否能检测慢性和急性缺氧？

答：在固体组织中发生两类缺氧 - 扩散限制的慢性缺氧和灌注限制的急性缺氧。慢性缺氧出现在由靠近血管的细胞消耗氧气而产生的氧梯度的远端，肿瘤的情况是由血管树中的 pO2 纵向梯度引起的局部氧气供应不足而加剧的（ Dewhirst et al., Temporal changes in pO2 of R3230AC tumors in Fischer-344 rats, Int J Radiat Oncol Biol Phys 42: 723-726, 1998）。慢性缺氧的存在意味着组织中的细胞以与氧气供应无关的速率消耗氧气，从而在远离血管的微小区域将 pO2 推向非常低的水平。也就是说，大多数细胞具有“调节”的细胞表型特征，通过平稳过渡到基于糖酵解的能量产生而适应低 pO2（Dewhirst et al., Temporal changes in pO2 of R3230AC tumors in Fischer-344 rats, Int J Radiat Oncol Biol Phys 42: 723-726, 1998）。

与具有静态、代谢控制的 pO2 梯度的慢性缺氧相比，急性缺氧与由血流不稳定性引起的 pO2 波动相关，肿瘤的情况是由短暂的血管阻塞造成的。急性缺氧的肿瘤细胞，由于是增殖的，可能比静止的、慢性缺氧的细胞在治疗上更相关。在正常组织中，波动的缺氧与缺氧再灌注损伤相关。关于 pimonidazole 是否能检测到慢性和急性缺氧，结合弱碱性取代基（pKa ≥ 8.0）的化合物在组织中浓缩约 3 倍于循环血水平。弱碱性化合物的这种性质是基于细胞内外 pH 差异对弱碱性化合物细胞内浓度的影响。特别是，在 pH 7.4 时，弱碱性 2-硝基咪唑在细胞内的浓度比细胞外浓度高 2 倍。这种浓度增加直接反映在缺氧细胞的放射增敏和用缺氧标记物标记的增加上。因为经历波动缺氧的细胞靠近血管并且 pH 相对较高，弱碱性、2-硝基咪唑缺氧标记物如 pimonidazole 在这些细胞中浓缩，因此急性缺氧发作导致与缺乏弱碱性官能团的缺氧标记物相比，结合水平更高。通过这种方式，pimonidazole 及其类似物在检测急性缺氧方面更优越（Kleiter, et al. A comparison of oral and intravenous pimonidazole in canine tumors using intravenous CCI-103F as a control hypoxia marker. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 64: 592-602, 2006 for further discussion and literature cited）。

9.问：在 pimonidazole HCl 给药后多久可以收获感兴趣的组织？

答：在收获过程中组织变得缺氧，循环中的 pimonidazole 结合可能会在原则上给出缺氧的错误测量。答案在于比较标记和收获期间组织对 pimonidazole 的接触程度。接触（pimonidazole 浓度 x 37°C 下的时间）在标记期间很大，在收获期间非常短，因为 pimonidazole 浓度限于收获时组织中的浓度。低标记浓度、快速收获和立即在冷介质中固定将消除可测量的非特异性结合水平。

在人类肿瘤研究中，活检通常在 pimonidazole HCl 输注后 16-24 小时进行。人类中 pimonidazole 的血浆半衰期约为 5 小时，因此 16 到 24 小时代表循环 pimonidazole 的 3 到 5 个血浆半衰期。这意味着在收获时 pimonidazole 的初始浓度为 1/8 到 1/32。这与活检材料快速转移到冷固定剂相结合，最小化了非特异性 pimonidazole 结合，如大多数靠近血管的细胞的低背景结合所示。

在一些人类肿瘤研究中，活检在 pimonidazole HCl 输注后 1.5 到 4 小时进行，并立即在液氮中固定。这种方法也给出了靠近血管的细胞的低背景结合。尽管在输注后 1.5 到 4 小时循环中的 pimonidazole 水平相对较高，但收获的组织中对 pimonidazole 的接触与体内标记期间对 pimonidazole 的接触相比非常短。

人类肿瘤的经验可以指导实验研究。小鼠中 pimonidazole 的血浆半衰期通常为 0.25 小时。在这种情况下，收获时间为 1-2 小时，与快速加入冷固定剂相结合，有效地消除了非特异性结合。这一结论对于涉及二氧化碳窒息的实验尤为重要，因为全局缺氧的持续时间定义不清。更快速的安乐死技术适用于较短的收获时间，只要进行快速组织收获并在冷固定剂中固定。

10.问：为什么将 pO2 阈值 ≤ 10 mmHg 设置为 pimonidazole 结合的基础？

答：在固体组织中测量 2-硝基咪唑结合的 Km(O2) 是困难的。迄今为止最好的实验是 Gross 等人。在固体组织球状体模型中，通过放射自显影测量放射性标记的 misonidazole 结合，与氧微电极测量的 pO2 进行比较。由于 misonidazole 结合导致的颗粒密度在 10 mm Hg 以下急剧增加（Gross et al. Calibration of misonidazole labeling by simultaneous measurement of oxygen tension and labeling density in multicellular spheroids, Int. J. Cancer 61: 567-573, 1995）。Chou 等人发现 pimonidazole 结合的 Km(O2) 与 HeLa 细胞中的 misonidazole 类似，并得出结论，10 mm Hg 也是固体组织中 pimonidazole 结合的合理阈值（Chou et al. Evidence that involucrin, a marker for differentiation, is oxygen regulated in human squamous cell carcinomas. Br. J. Cancer, 90: 728-735, 2004）。

固体组织的一个特征在稀疏的细胞培养中是不存在的，即氧气消耗创造了非常陡峭的 O₂ 梯度，以至于不同 Km(O₂₎ 被穿越的距离被缩短。例如，在肝组织中观察到陡峭的 pO2 梯度，其中 pimonidazole 加合物的免疫染色从背景到强烈染色仅跨越几个细胞直径。与组织中存在陡峭的 pO2 梯度一致的是，氧气调节蛋白如 involucrin 和碳ic anhydrase IX 的免疫染色模式与 pimonidazole 结合的模式非常相似，尽管氧气调节蛋白的 Km(O₂) 约为 15 mm Hg，而体外 pimonidazole 结合的 Km(O₂) 为 2-4 mm Hg（Chou et al. Evidence that involucrin, a marker for differentiation, is oxygen regulated in human squamous cell carcinomas. Br. J. Cancer, 90: 728-735, 2004 for further discussion）。

11.问：关于小鼠中 pimonidazole 药代动力学有哪些已知信息？

答：

1. Stratford et al. Pharmacokinetic studies of some novel (2-nitro-1-imidazolyl) propanolamine radiosensitizers. In: A. Breccia, C. Rimondi, and G. E. Adams (eds.), Advanced Topics on Radiosensitization of Hypoxic Cells, pp. 165-169. New York: Plenum, 1982.

2. Williams et al. In vivo assessment of basic 2-nitroimidazole radiosensitizers. Br J Cancer, 46: 127-137, 1982.

3. Walton et al. The reversible N-oxidation of the nitroimidazole radiosensitizer Ro 03- 8799. Biochem Pharmacol, 34: 3939-3940, 1985.

4. Walton et al. The effects of whole body hyperthermia on the pharmacokinetics and toxicity of the basic 2-nitroimidazole radiosensitizer Ro 03-8799 in mice. Br J Cancer, 55: 469-476, 1987.

5. Walton et al. Effects of localised tumour hyperthermia on pimonidazole (Ro 03-8799) pharmacokinetics in mice. Br J Cancer, 59: 667-673, 1989.

6. Workman, P. Accelerated elimination of pimonidazole following microsomal enzyme induction in mice: a possible approach to reduced neurotoxicity of the pimonidazole-etanidazole combination. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 16: 1011-1014, 1989.

12.问：体内 N-氧化是否会影响 pimonidazole 作为缺氧标记物？

答：pimonidazole 中的哌啶基团很容易被氧化成其 N-氧化物代谢物。原则上，这可能会影响 pimonidazole 作为缺氧标记物的有效性。（Arteel et al. Reductive metabolism of the hypoxia marker pimonidazole is regulated by oxygen tension independent of the pyridine nucleotide redox state. Eur J Biochem, 253: 743-750, 1998 for a detailed discussion of the metabolism of pimonidazole）。在体内，pimonidazole N-氧化物是通过黄素单加氧酶（FMO）的作用形成的。FMO 同工酶的分布因物种而异，产生不同的 N-氧化物血浆水平。有趣的是，pimonidazole 给药的途径（iv 或口服）对 N-氧化物的血浆水平影响很小（Kleiter et al. A comparison of oral and intravenous pimonidazole in canine tumors using intravenous CCI-103F as a control hypoxia marker. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 64: 592-602, 2006 for further discussion）。像过氧亚硝酸盐这样的强氧化剂，由超氧阴离子与一氧化氮（NO）反应形成，也可以氧化 pimonidazole。然而，N-氧化物的形成似乎并没有损害 pimonidazole 作为缺氧标记物的有效性。

首先，N-氧化物的形成可以通过血液中的血红蛋白-铁复合物的还原作用以及组织还酶如黄嘌呤脱氢酶和还原型细胞色素 P-450 来逆转，从而限制了 pimonidazole 因氧化而丢失（Walton et al. The reversible N-oxidation of the nitroimidazole radiosensitizer Ro 03- 8799. Biochem Pharmacol, 34: 3939-3940, 1985）。

其次，通过使用第二种缺氧标记物，已经表明 pimonidazole 标记的缺氧程度与推荐用于缺氧标记的 pimonidazole 血浆浓度无关。

第三，因为 pimonidazole 及其 N-氧化物衍生物对 anti-pimonidazole 抗体没有交叉反应性，N-氧化物不会干扰缺氧组织中 pimonidazole 加合物的检测（Kleiter et al. A comparison of oral and intravenous pimonidazole in canine tumors using intravenous CCI-103F as a control hypoxia marker. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 64: 592-602, 2006 for further discussion）。

13.问：如果 pimonidazole 染色模式似乎与组织缺氧不一致怎么办？

答：到目前为止，pimonidazole 加合物的免疫染色模式通常与组织缺氧的存在一致。然而，英国病理学家 Leon Cobb 曾经质疑，例如肝脏中心区域的高浓度硝基还原酶是否可能压倒 pimonidazole 结合的氧气抑制，并导致对该区域缺氧存在的错误的结论。我们通过检查大鼠肝脏中心区域在正常（顺行）和反向（逆行）灌注中 pimonidazole 的结合来应对这一重要挑战（Arteel et al. Evidence that hypoxia markers detect oxygen gradients in liver: pimonidazole and retrograde perfusion of rat liver. Br J Cancer, 72: 889-895, 1995）。逆行灌注导致中心静脉周围的肝脏区域氧化，而门静脉周围的区域缺氧。如果中心区域的高浓度氧化还原酶导致 pimoindazole 在氧气存在下结合，那么我们将期望在逆行灌注期间看到中心区域高水平的 pimonidazole 结合。实际上，逆行灌注将 pimonidazole 结合从氧化的中心区域转移到现在缺氧的门静脉周围区域，明确表明中心区域的高浓度细胞色素氧化还原酶本身并不取消 pimonidazole 结合的氧气抑制。这一概括的一个有趣的例外是围绕中心静脉的单层细胞。导致这些细胞在氧气存在下 pimonidazole 结合的生物化学仍然是一个谜。可能是它们具有硝基还原酶，有效地将还原当量（电子，氢化物离子）转移给硝基咪唑缺氧标记物，通过两个电子步骤，分子氧不能拦截它们。“二氢吡啶”就是这样一种酶，研究者在进入新领域时必须注意这一警告，关于 pimonidazole 结合。可以想象，例如，炎症细胞可以在没有组织缺氧的情况下结合 pimonidazole。首先，炎症细胞可以具有以对氧气不敏感的方式减少 pimonidazole 的硝基还原酶。此外，炎症细胞可以以足够高的速度消耗氧气以产生细胞内缺氧。在未标记细胞的海洋中标记的单个炎症细胞肯定会引起人们对标记细胞是否缺氧的担忧。

与 Cobb 的担忧类似，一些研究者询问，将细胞驱动到还原状态的高浓度 NADH 和 NADPH 是否可能取消 pimonidazole 结合的氧气抑制。答案再次是，不，在推荐的用于缺氧标记研究的 pimonidazole 浓度下（Arteel et al. Reductive metabolism of the hypoxia marker pimonidazole is regulated by oxygen tension independent of the pyridine nucleotide redox state. Eur. J. Biochem., 253: 743-750, 1998）。

一般来说，当 pimonidazole 结合的机制受到质疑时，有意识地操纵感兴趣的组织的缺氧是有用的。一种技术是让动物在 pimonidazole 接触期间呼吸 10% 的氧气。如果 pimonidazole 结合的程度超过了在空气中呼吸的动物，那么很可能缺氧是 pimonidazole 结合的原因。Parliament 及其同事在研究 misonidazole（pimonidazole 的密切相关类似物）的组织缺氧时利用了这种方法（Parliament et al. Nitroimidazole adducts as markers for tissue hypoxia: mechanistic studies in aerobic normal tissues and tumour cells. Br. J. Cancer, 66: 1103-1108, 1992）。使用“二氢吡啶”抑制剂，他们证明 misonidazole 的结合并非由于氧气不敏感的“二氢吡啶”型硝基还原酶的存在。同样，当通过氧气呼吸、碳酸氢盐呼吸、肼屈嗪注射或组织夹闭有意识地操纵肿瘤缺氧时，观察到 pimonidazole 结合和氧微电极测量之间有很好的相关性（r² = 0.85）（Raleigh et al. Comparisons among pimonidazole binding, oxygen electrode measurements, and radiation response in C3H mouse tumors. Radiat Res, 151: 580-589, 1999）。

还可以使用双重标记方法（见 Hypoxyprobe Gemini Kit）来检测改变组织 pO2 的干预措施之前和之后的单个组织中的变化。Van der Kogel 及其在尼姆根的团队在动物肿瘤中使用这两种标记物，pimonidazole pimonidazole HCl（Hypoxyprobe-1）和 CCI-103F（Hypoxyprobe-F6（Ljungkvist et al. Changes in tumor hypoxia measured with a double hypoxic marker technique. Int J Radiat Oncol Biol Phys, 48: 1529-1538, 2000）。

GERBU公司在原材料采购和制造领域有超过25年的丰富经验。GERBU提供广泛的精细化学品，生物试剂，缓冲液，洗涤剂，介质等。例如ACES、AEBSF、白蛋白、氨苄青霉素、抗生物素蛋白、DTT、甘氨酸、HEPES、IPTG、烟酰胺衍生物等。GERBU完美的生物相容性佐剂已经越来越成为单克隆和多克隆抗体生产的标准。

以下为GERBU佐剂的一些常见问题解答：

混合抗原肽FAQ:

Question：抗原-佐剂混合物是如何制备的?

Answer：将抗原溶液与佐剂按1:1的体积比加入无菌试剂瓶中，摇匀。避免泡沫形成。每只动物使用一根单独的无菌针。

Question：注射的最佳pH值是多少?

Answer：GERBU佐剂的pH值范围为5.6 - 5.8。推荐注射pH值为7.0-7.3。

Question：推荐使用哪些缓冲液?

Answer：我们推荐10 ~ 25 mM (pH = 7.3)范围内的Tris作为缓冲液。确切的浓度取决于蛋白质(抗原性)。

Question：根据说明书，应避免使用多价缓冲液(磷酸盐/柠檬酸盐)。助剂会絮凝吗?

Answer：如果可能的话，使用水(去矿化水)来稀释抗原。聚阴离子化合物会导致沉淀。如果不可避免，使用尽可能少的PBS。注射前请确保抗原/佐剂混合物没有凝固。

Question：我的抗原是稀溶的。你推荐哪种溶剂?

Answer：乙醇。将不溶于水的抗原溶解在乙醇中。然后用合适的水缓冲体系将乙醇预溶液缓慢稀释至10倍体积，再与佐剂配制成1:1的混合物。请不要超过5%乙醇的终浓度。

Question：哪些添加剂和溶剂不应该使用?

Answer：我们强烈建议不要注射变性剂(如SDS，尿素)和螯合剂(如EDTA)，以及大分子缓冲物质(如HEPES)。

抗原特性FAQ

Question：蛋白质复合物的非共价键被破坏了吗?

Answer：蛋白质的四级结构不受影响。通过这种方式，可以保留功能并相应呈现特定的表位。

Question：GERBU佐剂是否与细胞或DNA作为抗原混合?

Answer：您可以将GERBU佐剂与DNA或任何质粒混合。

Question：是否有将牛血清白蛋白溶解为抗原的处方?当必须使用弱抗原性的小分子进行免疫时，GERBU佐剂是否适合作为BSA的载体蛋白?

Answer：BSA作为小分子载体，增强抗原的抗原性和小分子表位的呈现。将500 mg粉状牛血清白蛋白溶于0.5 ml水(50% w / v)中，或350 mg牛血清白蛋白溶于0.65 ml 0.85% NaCl (35% w / v)中，配制成透明可给药的混合物。在免疫过程中，事先将这些溶液与GERBU佐剂直接按1:1的体积比混合。

Question：对于抗原性较弱的抗原，如何改进检测结果?

Answer：弱抗原比强抗原需要更有效的免疫启动物。但免疫时使用的抗原剂量不宜过高，以免宿主动物对抗原产生免疫耐受。建议更频繁地加强注射。

Question：有关于蛋白质结合能力的信息吗?

Answer：具体问题请联系技术支持。

注射FAQ

Question：免疫过程是如何进行的?

Answer：将免疫悬液置于室温或体温(20°C至37°C)。确保它不含任何大颗粒。使用无菌注射设备，将剂量缓慢地注入每个免疫部位。该应用是皮下实施到皮下脂肪组织。如果可能的话，在个体上形成一个皮肤褶皱，以便在那里注射。请按照相应的使用说明注射部位的数量和各自的最大体积。

Question：幼龄动物可以服用多少剂量?

Answer：根据方案与其他动物进行体重比较。

Question：也可以肌肉注射吗?

Answer：肌肉内注射通常是耐受良好的，但我们不建议这样做，因为它会给动物带来更多的压力。鸡可能会停止下蛋。

Question：为什么不静脉注射GERBU佐剂?

Answer：静脉注射违反了动物福利法。它不会提高整体效率。

Question：注射部位是否有免疫反应?

Answer：复合疫苗的作用可能有延迟效应，短期免疫原性反应是可能的。佐剂建立了一个仓库，并在皮肤下保持可见的短时间。

保质期FAQ

Question：GERBU佐剂保存在冰箱(4-8°C)中，原始包装未打开。在那里，可以看到细小的沉淀和凝集，并且看起来很粘稠。这个产品还可以注射吗?

Answer：GERBU佐剂自生产之日起稳定3年(2-8°C)。如果GERBU佐剂在不搅拌的情况下长时间存放在阴凉的地方，成分可能会分离和结晶。这对产品质量没有影响。一旦被带到室温和充分混合，得到均匀的悬浮液。

Question：GERBU佐剂在第一次收集后的保质期是多长?

Answer：在冰箱无菌条件下存放至少1/2年。

Question：佐剂-抗原混合物呈泡沫状/沉淀状/块状。它还能被使用吗?

Answer：不，因为期望的抗原性不再存在。此外，动物可能会受到伤害。

Question：GERBU佐剂与抗原混合后，这种乳剂在什么条件下可以保存多久?

Answer：当佐剂与抗原混合时，应直接注射乳剂。如果抗原稳定，乳剂可在室温下保存3个月。抗原/佐剂混合物的稳定性取决于抗原和缓冲液的性质。

与其它佐剂的比较FAQ

Question：GERBU佐剂的处理是否与弗氏佐剂(FCA/FIA)相当?

Answer：使用GERBU佐剂时，不需要用两支注射器制备乳剂。两种情况下抗原/佐剂的混合比例均为1:1。详细说明请参阅协议。

Question：不同品种的GERBU佐剂的批号是否存在差异?也就是说，不同批次在体内产生抗体的速率不同吗?

Answer：生产过程按GMP规范进行。所有的GERBU佐剂批号都要经过内部质量控制。检查佐剂的具体参数是否在规定范围内。特异性抗体滴度的产生不依赖于GERBU佐剂的特定批号。抗体的产生总是取决于动物的体质和所用抗原的性质。

Question：我之前使用的是GERBU佐剂10/100 / LQ。为什么它不再可用?

Answer：当时的配方差别不大，主要在于包装尺寸。我们进一步改进了配方，将三种产品合二为一。今天它被称为佐剂P。

Question：我之前用了不同的佐剂。现在我想切换到GERBU。我可以简单地继续给动物注射GERBU佐剂吗?

Answer：使用不同的佐剂系统会以意想不到的方式影响结果和动物的状况。我们建议在更换佐剂之前暂停注射一段适当的时间，以使动物的免疫系统有时间再生。但在短期实验中，无论如何不应改变佐剂。

特定应用FAQ

Question：通常会生成哪个抗体子类?

Answer：原则上，所有的抗体亚类都可以产生。实验装置必须作相应的调整。

Question：GERBU佐剂适合体外应用吗?

Answer：根据我们的经验，GERBU佐剂适用于产生重组抗体、嵌合抗体、合成抗体等。

Question：在体内使用GERBU佐剂是否可能在小鼠体内产生高质量和足够数量的针对天然表位的单克隆和多克隆抗体?

Answer：可以与活性物质(靶标)结合的生物分子类型和所使用的免疫原的三级/四级结构对免疫反应有很大影响，即抗原的三维形状及其复杂结构非常重要。

Question：我想使用GERBU佐剂进行商业抗体生产。除了产品价格外，我还需要支付许可费吗?

Answer：GERBU佐剂是为商业用途而开发的。没有额外的许可费。

Synaptic Systems（SySy）品牌成立于德国，专注于研发和生产针对突触和神经科学相关抗体，以及用于细胞生物学、组织病理学和高分辨率显微镜的各种抗体，除此之外，还推出与SySy抗体配套使用的试剂盒、试剂等产品组合，全方面满足客户的各种需求。抗体产品线主要有：突触活性区域相关抗体、突触后蛋白相关抗体、RNA修饰如m6A抗体、突触粘附蛋白抗体、SNARE相关抗体、Alzheimer's相关抗体、细胞骨架、离子通道相关抗体等。

那么接下来为各位同学整理出常见问题，希望这能帮到您。（重组以及储存）

1. 我应该如何重组抗体?

我们所有纯化的抗体都是从PBS中冻干的。

所以这也就解释了为什么好多同学疑问：我加了水以后到底是PBS溶液，还是正常溶液。

①为了在PBS中重组抗体，加入说明书中给出的去离子水的量。

所有的抗体都是在PBS中冻干，加了水，也就变成了PBS溶液，加水复溶到对应浓度即可，然后分装保存避免反复冻融~

如果需要更大的体积，按上述方法加水，然后加入所需量的PBS和稳定载体蛋白(如BSA)至最终浓度为2%。

注：由于一些抗体已经含有白蛋白。在添加更多的载体蛋白时要考虑到这一点。

②如果需要，添加少量叠氮化物或硫柳汞，以防止微生物生长。如果你想保持4°C的温度储存，特别建议这样做！

③重组荧光标记抗体后，加入1:1 (v/v)的甘油至终浓度为50%。这降低了你的抗体的凝固点，使你的抗体在-20°C时保持液态。

注：甘油也可以添加到未标记的一抗中。这是一种避免冻融循环的合适方法。

2. 我应该如何储存抗体?

收到抗体时：

我们所有的抗体和对照蛋白/肽都是冻干(真空冷冻干燥)粉末运输的，在环境温度下保持稳定，几周内不会损失质量。

①未标记和生物素标记的抗体和对照蛋白在重组前应保存在4°C。当它们还在冻干状态时，千万不要储存在冰箱里! 温度低于0°C可能会导致性能下降。

②收到荧光标记抗体后应立即重组。长期储存(几个月)可能导致聚集。

③对照肽重组前，应保存在-20°C。

重组后的长期储存(一般考虑)

①储存冷冻室不能是无霜(“无霜冷冻室”)：这种冻结和解冻之间的循环(以减少结霜)，正是应该避免的。出于同样的原因，抗体小瓶应放在冷冻室温度波动最小的区域，例如靠后而不是放在门架上。

②将抗体等分，并冷冻保存(-20°C至-80°C)：避免非常小的等分(低于20ul)，并使用尽可能小的储存瓶或管。等分越小，抗体在储存瓶或管表面的蒸发和吸附对储存液浓度的影响越大。

注：抗体在表面的吸附会导致活性的大量丧失。

③将甘油添加到最终浓度为50%时，并将抗体保持在-20°C的液态。这有效地避免了冻结和解冻循环。

产品存储的具体提示

Control proteins / peptides

储存于-20°C~ -80°C

Monoclonal Antibodies

Ascites和hybridoma supernatant应保存在-20°C ~ -80°C。

不建议在4°C下长时间储存! 与血清不同，腹水可能含有蛋白酶，可降解抗体。
Purified IgG应保存在-20°C~ -80°C。添加像BSA这样的载体蛋白会增加长期稳定性。我们的许多抗体已经含有载体蛋白。详细资料请参阅数据表。

Polyclonal Antibodies

Crude antisera:添加抗微生物药物后，可在4℃保存。 然而，最佳储存(-20°C ~ -80°C)。

Affinity purified antibodies

不如抗血清稳定。建议在-20°C ~ -80°C下保存。添加像BSA这样的载体蛋白会增加长期稳定性。我们的大多数抗体已经含有载体蛋白。详细资料请参阅数据表。

Fluorescence-labeled Antibodies

用1:1 (v/v)甘油，在-20°C下保存。保护这些抗体免受光照。

重点：避免所有抗体重复冻融循环!

概述

3Helix由约翰霍普金斯大学（Johns Hopkins University）的2位博士Yang Li & Michael Yu成立，是一家专业研发、生产、销售胶原蛋白杂交肽（collagen hybridizing peptides）的高科技公司。为科学家和临床医生提供新的工具来研究胶原蛋白病理，并开发具有高胶原蛋白重塑活性的疾病的诊断和治疗方法。

https://www.amyjet.com/brand/3Helix.shtml

在科研和医学诊断领域，准确检测损伤胶原蛋白对于理解组织修复、疾病进展和治疗响应至关重要。艾美捷科技在此分享关于新型多肽探针CHP检测损伤胶原蛋白的原理、优势及使用过程中可能遇到的常见问题。

CHP探针的适用性

Q1: CHP探针能否用于冰冻切片和石蜡切片染色？能否区分不同类型胶原蛋白？

A1: CHP探针适用于冰冻切片和石蜡切片的染色。它主要检测受损的胶原蛋白分子，而不区分胶原蛋白的具体类型。

CHP产品的稳定性

Q2: CHP产品在4°C溶液中的稳定性如何？溶解后能否在-20°C或-80°C下分装保存？

A2: CHP产品在4°C溶液中非常稳定，可保存一年而纯度几乎不下降。所有CHP产品均可在-20°C或-80°C下分装保存，但无需分装，因为肽在多次冻融循环后仍保持稳定。

CHP探针的使用

Q3: 是否每次使用CHP探针前都需要加热？

A3: 是的，每次使用前都需要加热CHP探针。加热后的CHP探针在化学和物理上都非常稳定，但不建议加热储备溶液，以免多次热冷循环。

染色操作的注意事项

Q4: 如果在组织切片染色时操作时间超过3分钟，会有影响吗？

A4: 操作时间超过3分钟不会影响实验结果。但建议尽量缩短CHP冷却时间以及加入CHP试剂的操作时间，以获得极高的结合率。

染色条件的选择

Q5: 为什么建议在4°C下进行CHP探针染色孵育？

A5: 在4°C下进行孵育可以增强CHP对变性胶原蛋白的亲和力，并且适用于冷冻组织切片的染色。

固定剂和染色时间的选择

Q6: 建议使用哪种固定剂或固定技术？染色结果是否取决于固定？

A6: 固定步骤不会决定染色结果。CHP染色不需要固定。如果需要固定，建议使用甲醛而非多聚甲醛或戊二醛。

共染色和抗原修复的影响

Q7: 如何在载玻片上进行CHP与抗体共染色？抗原修复是否会影响CHP染色？

A7: CHP与抗体共染色操作简单，可直接混合后进行孵育。抗原修复处理会增强CHP染色，但建议在未经AR处理的组织上进行CHP染色以检测自然降解或变性的胶原。

信号增强和对照选择

Q8: 使用生物素标记的CHP（B-CHP）是否可以增强信号？

A8: B-CHP可以通过荧光标记的链霉亲和素检测增强信号。对于阴性对照，建议使用未经预热的CHP溶液。

背景荧光的解释

Q9: 为什么在正常组织中会检测到一些荧光？

A9: 在正常组织中检测到背景荧光可能是由于CHP与天然组织中低含量降解胶原结合或组织的自发荧光。

推荐产品

艾美捷科技推荐以下产品用于胶原蛋白检测：

· CHP探针

· 荧光标记的链霉亲和素

· 甲醛固定剂

参考文献

1. In situ imaging of tissue remodeling with collagen hybridizing peptides. ACS Nano, 2017, 11, 9825-9835.

2. Visualizing collagen proteolysis by peptide hybridization: From 3D cell culture to in vivo imaging. Biomaterials, 2018, 183, 67-76.

艾美捷科技致力于提供高质量的科研产品和解决方案，助力科研和医学诊断的发展。如有任何疑问或需求，请随时联系我们。

       1.收到BioXCell产品后应如何处理？

收到抗体后，在分装储存及使用时需在生物安全柜中进行，并使用无菌枪头、离心管、注射器和缓冲液等，降低污染率。另外，使用前抗体要处于低温状态。 

2.如何正确保存BioXCell抗体产品？

请将抗体置于4℃避光储存。无菌操作。即使分装后，也不推荐将抗体冷冻保存。避免将抗体稀释至工作浓度后在4℃条件下储存超过一天，建议现用现配。  

3.万一没注意说明书上的储存要求，将抗体置于室温储存了一段时间，是否还可以继续使用？

一般来说，室温下放置几个小时不会影响抗体的活性，但是放置几天或者更长时间则有可能会导致蛋白降解，影响抗体活性，不建议使用。  

4.BioXCell抗体的保质期有多久？

按说明书要求储存，BioXCell抗体有效期为1年。  

5.BioXCell抗体是冻干粉还是液体形式？

BioXCell抗体均以无菌PBS缓冲液的形式提供。该溶液中不含稳定剂、防腐剂、载体蛋白、甘油或任何其他添加剂。抗体的pI值决定了PBS缓冲液的pH值。  

6.抗体收到后有漂浮物、絮状沉淀或聚集物是否正常？应如何处理？

存在聚集物或沉淀物属于正常现象，不会影响抗体的活性。可以在室温下轻轻摇晃使其溶解，或过滤或离心去除。  

7.Bioxcell抗体的浓度是多少？BioXCell不同批次抗体的浓度不同，但一般来说是在4到11mg/mL之间。包装的离心管上会标记抗体的具体浓度。如果需要在订购之前知道产品的确切浓度，请联系艾美捷科技。  

8.应如何稀释抗体至工作浓度？

建议使用官网推荐的InVivoPure系列专用稀释缓冲液来稀释BioXCell抗体，艾美捷在每个产品页面上都列出了每种抗体的推荐InVivo Pure 稀释缓冲液。在没有InVivoPure稀释缓冲液的情况下，可以使用与抗体PBS缓冲液pH相同或相近的的无菌PBS，以避免蛋白聚集。稀释时，建议使用预冷缓冲液，并在生物安全柜中操作，使用无菌枪头、试管、注射器和缓冲液来保持抗体的无菌性。应避免将抗体稀释至工作浓度后在4℃条件下储存超过一天。 

9.BioXCell抗体的氨基酸或DNA序列是什么？

我们的抗体是使用标准杂交瘤技术生产的，因此抗体的AA或DNA序列通常是未知的。  

10.BioXCell抗体的抗原表位是什么？

BioXCell不提供抗原表位信息，请客户自行参考文献。  

11.BioXCell抗体在体内的半衰期是多久？

厂家内部并没有抗体在体内的半衰期数据。因为抗体的半衰期是高度可变的，并且受到物种、同型、抗原分布、抗原浓度和许多其他因素的影响。建议阅读感兴趣抗体已发表的相关文献，参考与您实验条件及设计相近的实验数据，预估抗体的半衰期。 

12.BioXCell抗体是否适用于体内注射实验？

BioXCell所有的产品都是专门为体内使用而配制的。所有抗体均在无菌 InVivoPure缓冲液中配制。抗体溶液不含稳定剂、防腐剂、载体蛋白、甘油或任何其他添加剂。内毒素水平 <2EU/mg ( InVivoMab)，这使它们有资格进行大多数体内研究。为了满足最严格的要求，BioXCell还提供内毒素水平较低的抗体：<1EU/mg ( InVivoPlus)。  

13.BioXCell抗体是否适合体外应用？

可用于体外应用，例如细胞培养实验和诊断测定，包括蛋白质印迹、免疫沉淀、IHC、流式细胞术等。请参阅各个产品页面以获取已批准的列表每种抗体的应用。另外所有BioXCell抗体都是未偶联的，因此流式细胞术和免疫荧光等应用需要使用荧光染料偶联的二抗。  

14.小老鼠体内注射实验，应该多久注射一次？每次注射多少抗体？？

任何给定实验和抗体的最佳给药剂量和频率可能会因实验系统（即小鼠品系、疾病模型等）、实验持续时间、靶组织、抗原浓度和许多其他因素而有很大差异细节。出于这个原因，最佳剂量最好通过阅读与您感兴趣的抗体相关的产品参考文献来确定，以查找与您的实验系统类似的实验系统中的已发布数据。以此现有研究为起点，您可以通过实验优化给药剂量和频率。BioXCell的每种产品在产品网页上都有最新的参考列表。  

15.体内实验中同种型对照组是否重要？如何选择合适的同种型对照？

考虑同型对照处理组需要生成可靠的数据，因为它允许研究人员准确地区分以抗原特异性方式从初级抗体结合观察到的结果和从非抗原特异性结合或抗体注射的其他非特异性作用观察到的结果。同型对照抗体必须与一抗的宿主物种、同种型和亚类相匹配。为了方便我们的客户，我们在每个产品页面上列出了每种抗体的推荐的同型对照货号。  

16.如果觉得自己的抗体效果不佳，怎么办？

如果您怀疑您的抗体没有发挥最佳功能，请务必认真填写并提交技术服务申请表。您填写的实验信息越充分，BioXCell技术团队的建议才更可靠。  

17.如何申请和查询产品的COA？

官网自助链接：https://apps.bioxcell.com/certificate-of-analysis 

18.应该如何购买BioXCell抗体？

艾美捷科技是BioXCell中国区代理，欢迎咨询购买：400-6800-868  

19.Bioxcell InVivoMab和InVivoPlus两种级别的抗体有什么区别？

尊敬的客户：

感谢您选用艾美捷科技代理品牌的产品，您的信任和支持是我们的动力！ 

您可能注意到了部分产品的运输条件和保存条件不一致，也许这会让您担心产品的质量。我们非常 理解您的顾虑，对此我们特别说明如下： 

运输条件是根据在短期运输过程中不影响产品质量的原则，经由对应品牌厂家测试后制定的，可能 有别于推荐的长期储存条件（为了更长的保存时间）。某些产品在短期内（如运输时）不按长期保存条 件保存并不会影响到其质量。而那些在短期内对温度条件敏感的产品则将加蓝冰（冰袋）或干冰运输， 以防止温度骤变给产品稳定性造成影响。 

客户在收到产品包裹的时候，冰袋会出现融化的正常现象，它主要在整个运输过程中起到延缓温度 骤变的作用，厂家生产试剂时会有稳定性处理，不会影响效能。 

绝大部分试剂在实验开始前，需要将试剂恢复到室温。如果您收到货时温度为常温，不用担心，这 些都在厂家产品开发时的考虑范畴内。如果当日即用，就不用再解冻可以尽快实验，如当下不用，就尽 快按照产品长期储存温度保存即可，如果后续是多次使用则建议先分装后再保存，避免多次反复冻融。 如使用中遇到问题可以及时联系艾美捷科技。 

艾美捷以产品的品质为第一位，完全按照品牌厂家的运输条件执行，以最大的努力满足客户，赢得客户信赖。如您有任何关于产品保存和运输条件相关的疑问，请拨打我司服务热线：400-6800-868 或 027-59626688，我们将竭诚为您服务。 

此致，

敬礼！

武汉艾美捷科技有限公司         时间：2022 年 8 月 18 日星期四

储存：冻干粉原装储存在 2-8℃（不开封原装保存 3-5 年）。

溶解：加入一定体积 dH2O（参考特定说明书），溶解完全。工作液现用现配。

保存：

（短期保存）未稀释的液体，在 2-8℃下稳定约 6 周；

（长期保存）

方法一、水化后分装，置于-70°C 或以下冷冻保存，避免重复冻融。

方法二、添加等体积的甘油(ACS 级或更高)，终浓度变为原来的 50%，以液体形式储存于-20℃。

注意：加入甘油后使蛋白质浓度和稀释的范围都减半（比如：重溶后抗体的浓度是 0.8mg/ml，

体积 2ml，抗体稀释比例 1:5,000 - 1:100,000 for WB, 加入等体积（2ml）的甘油后, 抗体浓

度变成 0.4mg/ml，体积 4ml,抗体稀释比例变成 1:2500-1:50000 for WB）。

水化后保质期：自补水之日起一年。如果测试结果符合预期用途，则可以延长有效期

我们知道，ProSpec 相当一部分细胞因子和蛋白为冻干粉，这使得运输非常便捷，只要常温即可。而且，细胞因子和蛋白 冻干粉非常稳定，在-20℃或-80℃条件下可保存数年。冻干粉在使用前需进行溶解，然后以液体形式加到培养体系。溶解步骤非 常关键，因溶解不好会导致细胞因子或蛋白的失活，这也是很多用户在实际使用中经常遇到的问题。

那么，应该如何进行正确的溶解呢？ 

下面我们以 Recombinant Human IL-4 (重组人 IL-4，产品编号：CYT-211)的说明书为例，对细胞因子或蛋白的溶解方法 进行详细的阐述。 

拿到重组人 IL-4 的说明书后，您会发现有一段关于 Reconstitution(重悬)的叙述，这段内容含有溶解相关的所有信息。

1. Centrifuge the vial prior to opening  

第 1 步：开盖前离心试剂管 

ProSpec 的细胞因子或蛋白冻干粉装盛在塑料管中，为无菌包装。冻干粉在运输过程中可能会因颠簸而漂散并粘贴于管壁 或管盖上，所以在打开塑料瓶盖前，需将冻干粉通过离心收集到管底，以便用很小体积的液体即可将冻干粉完全溶解。 

有很多用户会问一个问题，即应该用多少转速、多长时间离心试剂管，才能达到良好的收集效果？ 

答：有些小型高速离心机(多为进口品牌)的面板上有一个 Spin 键，按了此键后，离心机会自动快速上升到其最大速度 (10000rpm 或 12000rpm)，上升到最高点后速度即刻下降，直至停止旋转，整个过程大约 30s。这个 Spin 键足以很好的将细 胞因子或蛋白收集到管底。但有些实验室没有这样的高速离心机，只有最高转速为 4000-4500rpm 的离心机。这种情况下，需 3000-3500rpm 离心 5min，也能达到类似的效果。

2. Reconstitute in water to a concentration of 0.1-1.0 mg/ml. Do notvortex. 

第 2 步：用无菌水重悬至 0.1-1.0 mg/ml，不可振荡。 

这个步骤即为溶解步骤，非常重要。 

1) 一定要用推荐的溶液重悬(或溶解)冻干粉 

用于溶解细胞因子或蛋白的溶液千差万别。此例中的重组人 IL-4 需用水溶解，而重组人 IL-2 (产品编号：CYT-209)则需用 20mM Acetic Acid (醋酸)溶解，重组人 TGF-beta1(产品编号：CYT-716）需用 10mMAcetic Acid (醋酸)溶解 (注：即使同一 重组细胞因子或蛋白，不同批次的溶解方法也可能有所不同，因此上面的叙述仅供参考。具体应该如何溶解应以相应批次的官方 说明书为准)。后续的文章中将对各种溶解液的配制方法进行详细的阐述，望继续关注。 

经常有用户会问，为什么会有这么多种溶解方法？ 

答：我们知道，蛋白的溶解性与很多因素有关，其中比较重要的是 pH 值和离子强度。ProSpec 的细胞因子或重组蛋白在 出厂前均经严格测试，说明上所标明的溶解液是能够将该细胞因子或重组蛋白完全溶解的液体。如果您所用的溶解液的 pH 值和 离子强度与说明书中所标明的不符，很多时候会造成细胞因子或重组蛋白不能完全溶解或者根本无法溶解，这样所配得的细胞因 子或重组蛋白必然活性不够或丧失。 

有不少用户没注意说明书上的描述，而是根据习惯，直接用 PBS 或培养液(1640 或 DMEM 等)等溶解细胞因子或蛋白的 冻干粉。这样做可以吗？

答：有时可以，要看具体情况。ProSpec 的大多数细胞因子或蛋白冻干粉的溶解液不是 PBS，此时千万不能用 PBS 或培 养液直接来溶解，具体原因在上面已经叙述过。而有部分细胞因子，如重组人 KGF 和重组人 FGF-23 等，说明书上的溶解液即为 1x PBS，此时用 PBS 溶解完全没问题，那么用培养液溶解也是可以的，不过最好还是用先用 PBS 溶解，然后再用培养液稀释。 

2) 一定要溶解到指定的浓度。 蛋白在一定的浓度范围内可以保持良好的稳定性，这个范围就是说明书上所标明的浓度范围，该例为 0.1-1.0mg/ml。 这个浓度范围对于不同的细胞因子或重组蛋白是不同的。 

高于或低于该浓度范围会有什么问题呢？ 

答：首先，细胞因子或蛋白会不稳定，即很容易出现活性下降的现象。其次，高于这个浓度范围，可能会超过该蛋白的 最大溶解浓度，即蛋白无法完全溶解。再者，高于或低于该浓度范围，蛋白可能会出现聚集(aggregation)，最终结果还是部分 蛋白未溶解，导致蛋白活性的减弱。 

3) 一定不能振荡(vortex)。 

这里所说的振荡是指用涡旋仪进行快速振荡。 

有用户会问，若想保证溶解液与冻干粉充分混匀，以实现细胞因子或重组蛋白的完全溶解，该怎么办呢？

答：多数细胞因子或重组蛋白的冻干粉是非常容易溶解的，一般我们用移液枪的枪头轻吹几下，即可使细胞因子或重组 蛋白完全溶解。 

对于不易溶解的细胞因子或蛋白，ProSpec 会在说明书中进行备注。这种情况下，您最好能将要溶解的细胞因子或重组 蛋白放在水平摇床(shaker)上低速摇一段时间，促使细胞因子或重组蛋白完全溶解。 

3. This solution can be stored at 2-8℃ for up to 1week. 

第 3 步：该重悬液在 2-8℃最长可保存 1 周。 

用说明书上推荐的溶液将细胞因子或重组蛋白重悬到推荐的浓度后，细胞因子或重组蛋白可放置在 2-8℃，即冰箱的冷藏室。 在这种条件下，细胞因子或重组蛋白的活性最长可保持 1 周。这对一个周期为 5-7 天的实验，如 DC(树突状细胞)的诱导成熟是 足够的。在此期间，只要每次从冰箱里吸取一定量的细胞因子或重组蛋白溶液加入到培养体系内即可。 

其实，说明书上推荐的浓度对于一般的实验来讲是比较高的。所以用户通常会将该溶液进一步稀释后再放在 4℃保存，待 1 周内用完。如进行稀释，必须遵照下面第 4 步的方法，即需用含载体蛋白的溶液进行稀释，否则稀释后的细胞因子或重组蛋白很 容易会粘附在管壁或瓶壁上，使得溶液中的细胞因子或重组蛋白的浓度下降，细胞因子或重组蛋白的总活性则大为减弱。

4. For extended storage, it is recommended to further dilute in abuffer containing a carrier protein (example 0.1%  BSA) and store in workingaliquots at -20℃ to -80℃. 

第 4 步：如要长期保存，则需用含载体蛋白(如 0.1% BSA，或 10% FBS，或 5% HSA)的溶液进一步稀释，然后分装冻存于-20℃ 至-80℃。 

如果一个实验周期长于一周，或配制的细胞因子或重组蛋白一次用不完，我们就需对细胞因子或重组蛋白进行长期保存。 方法是：将已重悬的细胞因子或蛋白用含载体蛋白，如 0.1%BSA(牛血清白蛋白)，10% FBS(胎牛血清)，5% HSA(人血清白蛋白) 的溶液将重悬液进一步稀释，然后分装冻存于-20℃至-80℃，即常规冰箱的冷冻室或超低温冰箱中。 

经常有人会在细胞因子或重组蛋白冻干粉用推荐的溶液重悬后直接分装冻存于-20℃至-80℃，这样可以吗？ 

答：不行。我们知道，塑料管壁对多数蛋白均有很好的吸附作用，也就是说溶液中的蛋白很容易粘附在管壁。粘附后， 蛋白是很难与管壁分离的。做过 ELISA 实验的人都知道，ELISA 的包被抗体(Capture antibody)就是通过这种粘附作用包被到酶 标板上的。 

载体蛋白，如 1% BSA，10% FBS(胎牛血清)和 5% HSA 等的主要作用是预先封闭塑料管壁上的蛋白结合位点，使细胞因子 或重组蛋白不会粘附于管壁。如果在细胞因子或重组蛋白冻干粉用推荐的溶液重悬后不用含载体蛋白的溶液进一步稀释，而直接 分装冻存，则溶液中的大部分细胞因子或重组蛋白均会粘附到管壁上，导致溶液中实际溶解的细胞因子或重组蛋白的浓度大为降 低，最终表现为细胞因子或重组蛋白活性的下降。 

因此，在分装冻存前，一定要用含载体蛋白的溶液将重悬液进一步稀释。稀释后的细胞因子或重组蛋白可为任意浓度，因大 量的载体蛋白可以保证低浓度细胞因子或重组蛋白仍然维持较高的稳定性。 

那么，含载体蛋白的溶液指的是什么溶液呢？水可以吗？ 

答：水不可。该溶液通常是指 pH 近中性，有一定缓冲能力的缓冲液，如 PBS，培养液(RPMI1640, DMEM 等)等。 

还有一个经常被问及的问题，即在做无血清培养或动物的体内实验时，细胞因子中不能含有 BSA，FBS 或 HSA 等动物或 人的蛋白，要想长期保存细胞因子或重组蛋白该怎么办呢？ 

答：一种方法是订购 ProSpec 的小包装细胞因子或重组蛋白，每次使用一只，用后即废弃。

5. 后续稀释液的配方：即原产品的溶液的配方。 

总之，为保证细胞因子或重组蛋白冻干份在重悬后仍能保持良好的生物活性，必须按照说明书中 Reconstitution 的方法 严格操作。 

蛋白有价，实验无价，愿大家珍惜每次实验机会，严谨认真，每次均能得到预期的实验结果！

1) 除少数例外，大多数人类细胞因子对小鼠细胞均有活性。

2) 许多小鼠细胞因子也可作用于人类细胞，但比活性可能低 于对应的人类细胞因子。 

3) IL-7 等为数不多的人类细胞因子作用于小鼠细胞时比对应的小鼠细胞因子活性更强。

4) 干扰素， GM-CSF, IL-3 和 IL-4 等细胞因子种属特异，对非同源细胞几乎没有活性。

5) 相反，成纤维细胞生长因子(FGFs)和神经营养素 (neurotrophins)高度保守，在不同动物种属细胞上均具有很好的活性。

ED50 为半数有效浓度，其定义是可诱导 50%最大反应的细胞因子浓度，这种活性表示法仅适用于剂量反应曲线呈 S 形 的细胞因子。其实，可以将 ED50 的值接理解为 1unit。如某种细胞因子或蛋白的 ED50 为 1ng/ml，那么 1ng/ml 即可看作是 1unit。 那么我们也不难理解，1mg(1x106ng) 该细胞因子或蛋白中应含 1x106/1= 106units. ED50(ng/ml)转化为 units/mg 的公式如下：

与市场上的许多蛋白产品不同，ProSpec 的产品中均不含载体蛋白或其它添加物(如牛血清白蛋白(BSA)，人血清白蛋白 (HSA)和蔗糖等，并且是以最低含盐量的溶液进行冻干的，因此冻干后常常不能形成白色网架结构，而是微量的蛋白在冻干过程 中沉积在管内，形成很薄或肉眼不可见的透明蛋白层。打开管盖前，我们建议您在小离心机中快速离心 20-30 秒，使附着在管盖 或管壁上的蛋白聚集于管底。我们的质控步骤保证每管中所含的蛋白量准确无误，虽然有时您无法看到蛋白粉末，但管中的蛋白 含量仍是非常精确的。