荧光素是最受欢迎和用途最广泛的生物发光底物。萤火虫荧光素酶/荧光素生物发光系统存在于萤火虫 （Photinus pyralis） 和其他几种甲虫中。荧光素酶通过二氧杂烯酮中间体氧化 ATP 激活的荧光素。萤火虫荧光素酶通过荧光素的 ATP 依赖性氧化产生光。该反应产生的 530 nm 化学发光在几秒钟内达到峰值，当荧光素和 ATP 过量时，光输出与荧光素酶活性成正比。长期以来，萤火虫荧光素酶一直与抗体偶联，并在免疫测定中使用荧光素作为检测底物用作标记物。与 HRP 和碱性磷酸酶相比，荧光素酶对化学修饰的耐受性较差。该酶的一个特殊优点是，除了高灵敏度外，哺乳动物组织中的内源性荧光素酶活性较低。荧光素酶的另一个重要用途是卫生监测领域。荧光素酶/荧光素系统可用于检测污染，因为所有生物体中都存在的 ATP 是产生发光所必需的。这种类型的 ATP 生物发光的主要应用是通过测试食品加工厂的表面来确定设备或产品是否存在任何污染来保证质量。
