蛋白质印迹手册之三：印迹原理与优化

将蛋白质上样到膜上的直接方法是通过过滤，一个溶解的样品可以通过抽真空而滤过膜。蛋白质吸附到膜上，而样品的其他组分则穿过膜。或者，将样品直接点在表面上，并让其干燥。固定在膜上的蛋白质随后可用于分析。

过滤（抽滤）

将蛋白质上样到膜上的直接方法是通过过滤，一个溶解的样品可以通过抽真空而滤过膜。蛋白质吸附到膜上，而样品的其他组分则穿过膜（图1）。或者，将样品直接点在表面上，并让其干燥。固定在膜上的蛋白质随后可用于分析。

图1. 利用过滤的印迹系统

斑点印迹（图2）和狭缝印迹是过滤方法的两个版本，它们采用多管吸印仪（manifold），将样品以斑点状或狭缝状上样到膜上。这些技术被作为快速筛选大量样品的定性方法，或分析相似样品的定量技术。它在测试实验设计参数是否适用于更复杂分析时特别有用。

图2. 利用Western 化学发光HRP底物在人血清的斑点印迹上检测转铁蛋白（详见操作步骤1.4 斑点印迹）。利用山羊抗转铁蛋白抗体和兔抗山羊HRP结合的二抗，在P转印膜上检测连续稀释血清中的转铁蛋白，重复两次。

过滤方法的另一个版本是网格免疫印迹，当样品量非常有限，无法用ELISA等传统技术来开展分析时，这种技术很有用，适合高度并行的样品分析。例如，网格免疫印迹已用于过敏原特异的抗体应答鉴定，只需要极少量的患者血清。

在制备过滤法印迹时，请注意以下方面：

? 去污剂会抑制蛋白质吸附到膜上。样品溶解和清洗所用的缓冲液中的去污剂应不超过0.05%，且只在需要时添加。

? 样品量应足够大，以覆盖每孔中暴露的膜，但又不能超过膜的结合能力。

? 颗粒负载高的样品可能会堵塞膜，而那些高粘度的样品会降低流速。颗粒应通过预过滤或离心来去除，并只将上清上样到膜上。粘稠的样品应用缓冲液稀释。