染色质免疫沉淀—交联染色质免疫沉淀(X-ChIP) 操作步骤

染色质免疫共沉淀是一种强力的手段，来联系蛋白质或其修饰位点与基因组的关系。染色质分离并用特异性抗体判断是否与特异性DNA 序列相结合。染色质免疫沉淀法亦可用来检测目的位点在基因组中的时空分布（用芯片或DNA 测序）。本操作规程详细阐述了交联染色质免疫沉淀(X-ChIP) 实验的具体步骤。

1.交联和细胞收集

(用甲醛来使蛋白质和DNA 相交联。交联的时间很关键，因此需优化。建议样本交联的时间为2-30 分钟。

过度的交联可降低抗原的可结合性和超声的效率。抗原的表位也会被遮盖。甘氨酸可抑制甲醛的作用并终止交联反应。)

1.1 取2 个150cm2 培养皿的融合细胞(每皿细胞数约1 X 107 - 5 X 107 个)。向培养基中滴加甲醛以使蛋白和DNA 相交联，甲醛的终浓度为0.75%（体积百分比），室温下轻轻摇动10 分钟。

1.2 加入甘氨酸至终浓度为125mM，轻轻振荡孵育5 分钟。

1.3 用10ml 冷PBS 洗涤细胞2 次。

1.4 刮下细胞并用5ml 冷PBS 收集，转移至一个50ml 离心管中。

1.5 用3ml PBS 洗涤培养皿，收集剩余细胞至50ml 离心管中。

1.6 1000g 离心5 分钟

1.7 小心吸弃上清液，用FA 裂解缓冲液重悬沉淀(每1 X 107 个细胞加750μl)

(用细胞悬液实验时，起始细胞量为1x107- 5x107 个细胞，并按照第一部分的步骤加入体积百分比0.75% 的甲醛和甘氨酸。

离心沉淀细胞（5 分钟, 1000g）。用冷PBS 洗涤3 次，用FA 裂解液重悬沉淀（每1 X 107个细胞加750μl）。然后转到步骤2.1。)

2. 超声

当使用组织来进行实验时（见步骤6.2），要得到单细胞悬液，应从此步超声处理开始。

2.1 将裂解液超声处理以使DNA 断裂成约500-1000bp 的片段。不同的细胞系需要不同的超声时间，因此需分别进行优化。

交联后的裂解液应进行超声处理，并优化得到最佳条件。取部分样本按照步骤3 进行DNA 分离。

片段大小应按照图1 所示，用质量百分比1.5% 的琼脂糖凝胶分析。

2.2 超声处理后，4°C，8000g 离心30 秒使细胞碎片沉淀。将上清液转移到新管中。此染色质溶液将用于步骤4的免疫沉淀（IP）。

2.3 每个超声后的样本均取50μl，此样本为抽样样本，用于定量DNA 浓度（见步骤3），并作为PCR 的对照样本。

(超声后的染色质可在液氮中速冻，在-80°C 中可保存2 个月。应避免反复冻融。)

图1. U2OS 细胞分别超声5、10、15 和20 分钟。随时间的延长，所得片段大小逐渐减少。超声15 分钟后可得到最适片段大小。

注意：超声时间过长会使核小体与DNA 的交联断裂，因此条带大小不应低于200bp。

3. DNA浓度测定

3.1 抽样样本用来测定DNA 浓度，为后续IP反应提供数据。用PCR 产物纯化试剂盒（加70μl 洗提缓冲液，转至步骤3.2a）或酚:氯仿（加350μl 洗提缓冲液，转至步骤3.2b）来纯化DNA。

3.2a 加入2 μl RNA 酶A (0.5 mg/ml)。置于65°C 恒温振荡4-5 小时（或过夜）以解交联。按照PCR 产物纯化试剂盒说明书来纯化DNA。用DNA 纯化试剂盒来纯化DNA 时，RNA 浓度过高会干扰DNA 的纯化过程，因此样本中应加入RNA 酶A 处理。否则纯化柱吸附饱和时产物会大大减少。

3.2b 加入5μl 蛋白酶K (20mg/ml)。65°C 恒温振荡4-5 小时（或过夜）以解交联。酚:氯仿抽提DNA，乙醇沉淀中加入10μl 糖原(5 mg/ml)。用100μl 水重悬沉淀。样本可冻存于-20°C 冰箱中。样本用蛋白酶K处理，可使脂肪与芳香族氨基酸的羧基邻近的肽键断裂。破坏蛋白质和DNA 的交联可帮助DNA的纯化。

3.3 DNA 浓度测定: 取5μl 纯化DNA，加入装有995μl TE的离心管中，200 倍稀释，测定OD260。根据公式DNA 浓度（μg/ml）=OD260 x10,000，计算每毫升染色质溶液中DNA的浓度。

4. 免疫沉淀

4.1 使用步骤2.2 中得到的染色质溶液继续此操作。建议每个免疫沉淀反应DNA 含量约为25μg。每个样本用RIPA 缓冲液1:10 稀释。应设一个抗体对照和一个仅加磁珠的对照。

4.2 除对照外，其余样本中均加入一抗。事先应通过预实验得到最佳的抗体加入量。一般来说，每25μg DNA 加入1-10μg 抗体。

4.3 所有样本均加入20μl 的蛋白A/G 磁珠（预吸附了鲑鱼精DNA 和牛血清白蛋白，见步骤4.3a），进行免疫沉淀反应，4°C旋转过夜。

4.3a 蛋白A/G 磁珠与鲑鱼精DNA 混合液的制备：如果使用蛋白A 和蛋白G 两种磁珠，应将其等体积混合，并用RIPA 缓冲液洗涤3 次。

吸弃RIPA 缓冲液，加入鲑鱼精DNA 至终浓度75ng/μl，同时加入牛血清白蛋白至终浓度0.1μg/μl。加入等体积RIPA 缓冲液，

常温旋转孵育30 分钟。用RIPA 缓冲液洗涤一次，然后加入等体积RIPA 缓冲液。

应使用蛋白A 磁珠、蛋白G 磁珠或两种混合物。61 页第9.5 部分的表中列出了两种磁珠对不同种属免疫球蛋白的不同亲和性。

4.4 将蛋白A/G 磁珠离心，2000g 1 分钟，弃上清。

4.5 用1ml 洗涤缓冲液洗涤磁珠3 次。2000g 离心1 分钟。

4.6 用末次洗涤缓冲液洗1 次。2000g 离心1 分钟。

(如果背景过高，则应增加洗涤次数。或者，在步骤4.2 之前将超声处理后的染色质与蛋白A/G 磁珠共孵育1 小时，以去除背景。

此步将消除与磁珠的非特异行结合。将上清液（超声处理的染色质）转移至一个新管中，然后按照前述步骤4.2 将抗体与磁珠孵育。)

5. 洗涤和解交联

5.1 洗涤DNA：向蛋白A/G 磁珠中加入120μl 洗涤缓冲液，30°C 旋转15 分钟。

5.2 2000g 离心1 分钟。将上清液转移至新管中。样本可于-20°C 保存。

5.3 纯化DNA 可用PCR 纯化试剂盒（见步骤3.2a）或酚:氯仿（加280μl 洗提缓冲液，然后参照步骤3.2b）法进行。

5.4 DNA 可用实时PCR 进行定量检测。可用实时PCR 仪自带的软件进行引物和探针设计。或者，也可以使用在线设计工具进行设计。

6. 组织免疫沉淀中染色质的制备

此步骤描述了从组织中制备染色质，以用于后续的染色质免疫沉淀反应。每个免疫沉淀/抗体反应推荐使用组织30mg，但组织使用量可根据实际进行调整。每种组织的用量依据组织蛋白丰度、抗体亲和力和交联效率而定。每个免疫沉淀反应最适染色质的量为5-15μg。每次交联免疫沉淀反应之前，需根据不同组织类型确定具体的染色质需要量。应先按照下述方法制备染色质溶液，

再进行交联免疫沉淀反应。所有溶液中均应添加蛋白酶抑制剂（10μl/ml 的PMSF，1μl/ml 的抑肽酶和1μl/ml 的亮肽素，溶于PBS 中）。
本部分摘自Henriette O’Geen, Luis G. Acevedo 和Peggy J. Farnham 提供的操作规程。
6.1 交联

(冰冻组织应置于冰上融化（根据组织用量的不同，此过程可能需要几个小时不等）。注意，冰冻组织融化时温度不能过高，以免蛋白酶活化使组织降解。操作过程中样本要一直置于冰上，所有操作均应迅速完成，以使其处于融化状态的时间最短。组织切块时要在培养皿中进行，其下要放置一块干冰。)

6.1.1 用刀片将冰冻或新鲜组织切成小块（1-3mm3）

6.1.2 取一个空的15ml 锥形离心管，称重，放入组织后再次称重，计算组织重量。

6.1.3 在通风橱中配制交联所用溶液。每克组织加10ml 磷酸盐缓冲液。加入终溶度1.5%（v/v）的甲醛，室温旋转15 分钟。

6.1.4 加入甘氨酸至终浓度0.125M，以终止交联反应。继续室温旋转5 分钟。

6.1.5 组织样本离心，4°C 720 rpm，离心5 分钟。

6.1.6 吸弃培养基，用10ml 冰上预冷的PBS 洗涤。4°C 720 rpm，离心5 分钟，弃掉洗涤缓冲液。

(此步所得组织可以用液氮速冻，然后保存于-80°C。应避免反复冻融。

如果随后使用，可以用冷PBS 重悬组织，每克组织加10ml，冰上放置。)

6.2 组织降解

应用Becton Dickinson 生产的Medimachine（中型研磨器）处理得到单细胞悬液。每克组织使用2 个中号锥形研磨管(50μm)。

6.2.1 将1ml 枪头的末端剪掉，使吸头口增大。

6.2.2 50-100mg（3-4 块）的组织用1ml PBS 重悬。

6.2.3 将溶液加入锥形研磨管中，研磨2 分钟。

6.2.4 将18 号钝圆的针头连接到1ml 注射器上，将其插入锥形研磨管中收集细胞。将细胞加入一个锥形管中，冰上放置。

6.2.5 重复步骤2.2 直到所有组织均处理完。

6.2.6 镜下观察细胞悬液，以确定得到的是单细胞悬液。如果需要进一步研磨，可在组织中加入更多的PBS，重复步骤2.2 到2.5 直至所有组织均研磨成均一的悬液。

6.2.7 将细胞离心，1000rpm，4°C，离心10 分钟。估算细胞沉淀的体积以备下一步操作。

6.2.8 小心吸弃上清液，用FA裂解缓冲液重悬沉淀（每1x107 个细胞加入750μl）。

6.2.9 从第2 阶段（超声处理）开始，继续进行交联染色质免疫沉淀反应。