TEQUILA-seq：多功能且低成本的全长RNA分子靶向测序技术

在过去的十多年中，短读长RNA测序（RNA-seq）已被广泛用于转录组分析。但由于其读长较短，因此短读长RNA测序在解析全长转录本异构体和复杂RNA加工事件的能力上受到很大限制。相比之下，长读长测序技术可以生成长度超过10kb的序列，从而直接对全长转录本进行测序。但长读长测序的通量相对较低，这也成为限制其在转录组分析领域广泛应用的一大瓶颈。

费城儿童医院的研究人员近日开发出一种多功能且低成本的全长RNA分子靶向测序技术，有望加速新的诊断和治疗方法的发现。与商业化的靶向RNA测序解决方案相比，这项名为TEQUILA-seq的技术具有很高的成本效益，适用于不同的研究和临床用途。

这篇题为“TEQUILA-seq: a versatile and low-cost method for targeted long-read RNA sequencing”的论文于8月8日发表在《Nature Communications》杂志上。

在翻译成蛋白质之前，RNA分子可能会以不同的方式切割和连接。这个过程被称为选择性剪接，它允许一个基因编码几种不同的蛋白质。

尽管选择性剪接发生在许多生物过程中，但它在癌症等疾病过程中可能失调，带来致病性的RNA分子。为了了解选择性剪接如何导致疾病，研究人员需要对单个基因产生的所有RNA分子（又称为转录异构体）进行准确的记录。

长读长RNA测序平台可以实现这种分析。它对长度超过10,000个碱基的RNA分子进行端到端测序，捕获整个转录异构体。然而，这些长读长平台的测序产量不高，这阻碍了它们的广泛采用，特别是在临床环境中。靶向测序是在测序之前富集感兴趣的特定核酸序列，可以大大提高目标的测序深度。

共同通讯作者、费城儿童医院雷蒙德-佩雷尔曼细胞与分子治疗中心的Lan Lin博士称：“长读长RNA靶向测序是一种强大的策略，可以阐明任何一组预定义基因的RNA库。然而，现有的全长RNA分子靶向测序技术要么昂贵，要么难以建立，这使得许多实验室望尘莫及。”

“TEQUILA-seq解决了这个问题，因为它价格低廉，简单易用。用户可以根据不同的目的调整这项技术，研究人员可以选择他们想要测序的基因，并在自己的实验室中制备靶向捕获所需的试剂。这有望帮助人们开发各种疾病的新型诊疗方案。”

在靶向富集时，人们通常采用杂交捕获方法。这种方法以寡核苷酸片段作为捕获探针，从生物样本中捕获和分离其目标序列。然而，尽管杂交捕获是一种有效的靶向测序方法，但商业合成的生物素化捕获探针价格贵，只能用于有限数量的反应，这使得每个捕获反应的单个样品成本很高。

为了克服这一限制，费城儿童医院的研究人员开发出TEQUILA-seq（利用等温线性扩增探针和长读长测序的转录本富集和定量)。TEQUILA-seq的关键创新点之一是采用了一种由核酸内切酶触发的等温链置换扩增反应，它能够以非生物素化的寡核苷酸作为模板来合成大量的生物素化捕获探针。

仅仅使用2 ng的模板寡核苷酸，研究人员就可以生成高达25 ug的TEQUILA探针，用于至少250个捕获反应。这种合成捕获探针的创新策略使得TEQUILA-seq具有很高的成本效益，并具有可扩展性，适用于大型的分析组合和大量的生物样品。

为了对其性能进行基准测试，研究人员在多个基因组合上对合成RNA或人类RNA进行了TEQUILA-seq分析。TEQUILA探针在目标捕获和富集方面的表现与商业捕获探针一样好，而每次捕获反应的成本却低数百倍。此外，研究人员还证明，TEQUILA-seq可以在定量目标RNA分子的同时大大提高检测能力。

共同通讯作者、费城儿童医院计算与基因组医学中心主任Yi Xing博士表示：“TEQUILA-seq使用便宜的试剂和简单的实验流程，就能够对许多生物样品中的全长RNA分子进行深度测序。这非常令人兴奋，它让广泛的医学应用成为可能，从RNA引导的基因诊断到疗法开发。”

为了展示这项技术的生物医学用途，研究人员采用TEQUILA-seq分析了40个乳腺癌细胞系中468个癌基因的全长RNA分子。他们在广泛研究的癌基因中发现了以前未知的转录异构体，这也许会揭示保护机体免受癌症侵袭的基因是如何失活的。

“我们的工作表明，TEQUILA-seq可以广泛应用于全长RNA分子的靶向测序，”Lin博士说。“此外，TEQUILA探针是通用型捕获探针。它们可以与长读长和短读长测序平台上的靶向RNA和DNA测序兼容。以低成本轻松生成大量生物素化捕获探针的能力有助于许多基础、转化和临床应用中的大规模和群体水平研究。”

原文检索：

Wang, F., Xu, Y., Wang, R. et al. TEQUILA-seq: a versatile and low-cost method for targeted long-read RNA sequencing. Nat Commun 14, 4760 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40083-6