蛋白质印迹—样品准备和蛋白质浓度的测定

一、样品准备

裂解缓冲液

准备凝胶电泳的样品，需要对细胞和组织进行裂解以释放目的蛋白，这些可溶性蛋白能够穿过分离胶单独移动。裂解缓冲液有很多种，但用 来做 WB试验的仅有少数几种。简单来说，它们溶解蛋白的能力不同，含有十二烷基硫酸钠和其他离子型去污剂的溶解能力最强。

有些购买的抗体能够识别降解和变性蛋白质，因此应该在降解和变性条件下使用该类抗体。需要注意的是一些抗体仅仅识别天然的、非变 性蛋白质，故不能识别经去污剂（SDS、脱氧胆酸盐、弱降解作用的 Triton X-100 和 NP40）作用的蛋白质。

选择裂解缓冲液首先要考虑选择的抗体是否识别变性的样品。如果不能，有关资料会列在抗体说明书上，应该使用不含去污剂的缓冲液或者 是相对温和的非离子型缓冲液（NP-40，吐温 X-100）。

蛋白定位和裂解液的选择

*专门或主要表达在亚细胞结构区域的蛋白在亚细胞裂解物中比在全细胞和组织裂解物中更为富集。这对于提取弱表达蛋白非常重要。例如， 相对于全细胞或全组织裂解物来说，核表达蛋白在细胞核裂解物总蛋白中占有相当大的比例，这样凝胶条带中可以载入更多的目的蛋白。 另一个优点是排除了杂质成分潜在的交叉反应。请参考我们的亚细胞结构分离技术方案。

Nonidet – P40（NP40）缓冲液

这是研究细胞质蛋白、膜结合蛋白或者全细胞抽提物等常用的一种缓冲液。如果目标蛋白不能完全从不溶性或凝集物中提取，RIPA 缓冲液将 会更合适，它包含的离子型去污剂能更好溶解蛋白。

RIPA缓冲液（放射免疫沉淀分析缓冲液）

这种缓冲液对全细胞提取物和膜结合蛋白都非常有用，对提取细胞核蛋白来说，这种缓冲液比只含有 NP40 或 Triton X-100 的缓冲液更受欢 迎。但它会破坏蛋白与蛋白之间的相互作用，因此这在免疫沉淀测定中会有些问题。

在需要保存蛋白与蛋白相互作用，或者将蛋白变性降到最低（例如，抗体只能识别一个非变性表位）时，应该使用不含离子型去污剂（SDS）的缓冲液和不含非离子型去污剂（Triton X-100）的缓冲液。用不含去污剂的裂解液，一般需配合机械剪切来裂解细胞，常用的 Dounce 均浆器 或者将细胞反复通过注射器针头。这时简单的Tris缓冲液就足够了，但是对于膜结合蛋白或细胞骨架蛋白则需要含有去污剂的缓冲液。

蛋白酶和磷酸酶抑制剂

一旦裂解发生，水解、去磷酸化和变性就开始了。如果样本在冰上或始终在 4°C 存放以及一开始就往裂解液中加入适当抑制剂的话，这些反应将可以大大减缓。混合（“鸡尾酒”）的蛋白酶和磷酸酶抑制剂已经商品化，也可以自己研制抑制剂的配比。

原钒酸盐准备

所有步骤均在通风橱中进行。

1.用双蒸水溶解原钒酸钠至 100mM。

2.用盐酸调 pH 值至 9.0。

3.加热至无色。为尽量减少由于蒸发所致体积减小，加热时加盖。

4.冷却至室温。

5.调 pH 值至 9.0。

6.再次加热至无色。

7.再次加热冷却重复以上循环直至加热冷却后溶液 pH 值保持在 9.0。

8.用水补至起始体积。

8.-20°C 分装保存，若变黄则废弃。

细胞培养裂解物的制备

1.将细胞培养皿放置冰上并用冰冷的 PBS 洗涤细胞。

2.吸干 PBS 后，再加入冰冷的裂解液（每 107 细胞 / 100mm2 培养皿/150cm2 培养瓶加 1ml，每5x106 细胞 / 60mm2 培养皿/ 75cm2 培养瓶 加 0.5ml）。

3.用预冷的塑料细胞刮刀将贴壁细胞从培养皿上刮下，然后轻轻将细胞悬液转移到预冷的小离心管中。

4.4°C 持续振荡 30 分钟。

5.4°C 预冷微型离心机中 16,000 x g 离心 20 分钟。

6.从离心机中轻轻地取出离心管放置在冰上。将上清液吸出转移到预冷的新管（放在冰上）中，弃沉淀。

组织裂解物的制备

1.用干净器械解剖所需的组织，最好在冰上，并快速操作以防止蛋白酶降解。

2.将组织放入圆底离心管或 Eppendorf 管中，浸入液氮中“速冻”。样本在 -80°C 储存备以后使用或放在冰上立即匀浆。对于约 5mg 组织，向管中迅速加入约 300μl 裂解液并用电动匀浆器均浆，裂解液冲洗刀片两次，每次 300μl，然后 4°C 持续振荡 2 小时（将 回旋振荡器放入冰箱）。裂解液的体积根据组织总量来决定。蛋白提取物不宜过于稀释，以避免蛋白质损失，并尽量减少样品体积以便凝 胶上样。最小浓度为 0.1mg/ml；最佳浓度为 1-5mg/ml。

3.微型离心机 4℃ 16,000rpm 离心 20 分钟。从离心机中轻轻地取出离心管放置在冰上。吸出上清液放入预冷的新管（放在冰上）中，弃沉淀。

二、蛋白质浓度的测定

用 Bradford、Lowry 或 BCA 方法测定蛋白质含量，牛血清白蛋白是常用的蛋白标准。

一旦确定了每管的蛋白浓度就可以在 -20°C 或 -80°C 冷冻样品备用，或为免疫沉淀反应或凝胶上样做准备。

凝胶上样：变性的和天然的，还原的和非还原的

1.a) 变性、还原样品

抗体特异性识别目标蛋白的部位（即抗原表位）可能存在于蛋白的三维构型内部。为了能使抗体接近抗原表位，必须将蛋白的三维构型打开， 即使蛋白变性。

要使蛋白质变性，使用含阴离子变性去污剂十二烷基硫酸钠 (SDS) 的上样缓冲液，95-100°C 煮沸 5 分钟，或者在 70°C 加热5-10 分钟，尤 其是研究跨膜蛋白时，因为煮沸更易聚集，聚集物不能有效的进入胶中。

标准品上样缓冲液叫做2倍Laemmli缓冲液，最初描述在《自然》杂志上（1970 Aug 15;227(5259):680-5.）。也可以用4倍和6倍的样品缓冲 液，可以减少缓冲液对样品的稀释。2 倍的样品缓冲液和样品以 1:1 的比例混合。

使用 SDS，通过 SDS 阴离子的粘附作用，所有的蛋白质都带负电荷，SDS 通过“缠绕”多肽链使蛋白变性。SDS 以 1.4:1 的比例结合到蛋白 上，SDS 赋予多肽的负电荷数与蛋白的长度成比例，即变性的多肽成为负电荷云的“棒”，每一单位长度的多肽带有相同的电荷数或电荷云密度。

在变性 SDS-PAGE 中，迁移率不是由多肽固有的电荷数目来决定，而是由多肽的分子量来决定。SDS 的纯度尤为重要，蛋白质被染色的背 景与蛋白条带能显示出 SDS 质量的好坏。

通过加入β巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT），按照分子量大小进行分离，在蛋白形成自由弯曲之前减少二硫键的形成是非常必要的。上样缓冲液中加入甘油能增加样品的密度，使样品停留在样品池的底部，防止外溢和使凝胶上样不规则。

为了能看到蛋白的迁移，通常在上样缓冲液中加入小分子的离子型染料（如溴酚蓝）。染料在混合物中的迁移速度最快，能够提供一个迁移 前沿来监测分离的过程。

蛋白质样品处理时，加热前后都要用漩涡振荡器彻底混匀样品，使溶解彻底。

2.b) 天然的未降解样品

有些抗体识别的抗原表位在抗原的天然构型中由非临近氨基酸组成。虽然这些氨基酸在原始序列中是彼此分开的，但它们在蛋白的三维结构 中是相互靠近的。抗体只能辨认在折叠结构表面上的抗原。

在这样的情况下进行非变性条件 WB 是不可避免的，这一点会在产品的数据表上的应用部分提到。总之，非变性条件就意味着样品和电泳缓 冲液中不加入 SDS，以及不加热样品。

有些抗体仅仅识别非还原形式的蛋白质，如氧化形式（特别是半胱氨酸残基）的蛋白质。引起降解的试剂β巯基乙醇和 DTT 必须从上样缓冲 液和电泳缓冲液中除去。