mRNA内部m7G修饰的首个识别蛋白QKI (Quaking)

m6A修饰是mRNA上丰度最高的内部修饰，RNA修饰的通过特定的识别蛋白：YTHDF蛋白家族、YTHDC蛋白家族、IGF2BP蛋白家族等均可特异性识别mRNA上的m6A位点，从而调控mRNA代谢。mRNA上存在很多不同种类的化学修饰、比如m1G、m5G、m7G等。2019年，证实了m7G修饰存在于哺乳动物mRNA和miRNA的内部，并报道了METTL1-WDR4复合体作为相应的甲基化转移酶。同时，中国科学院北京基因组研究所杨运桂教授开发了新的检测技术，获得了mRNA内部m7G修饰 的高分辨率图谱。然而迄今为止，mRNA内部m7G修饰的特异性识别蛋白尚不清楚，这极大地阻碍了对mRNA内部m⁷G修饰功能的研究。因此，鉴定mRNA内部m7G修饰的特异性识别蛋白具有十分重要的意义。

2023.6.27，来自美国希望之城国家医疗中心陈建军教授、苏瑞助理教授及上海交通大学医学院附属仁济医院的夏强教授合作，在Cell上发表标题题为 QKI shuttles internal m7G-modified transcripts into stress granules and modulates mRNA metabolism 的研究文章，筛选并鉴定出mRNA内部m7G修饰的首个识别蛋白QKI (Quaking)，而且报道了在应激状态下QKI对细胞应激颗粒内具有m7G修饰mRNA的动态调控作用。

研究者首先验证了METTL1-WDR4甲基转移酶复合体对mRNA内部m7G的修饰作用。敲除METTL1/WDR4显著降低small RNA和mRNA内部m7G的丰度；过表达野生型METTL1可增加small RNA和mRNA内部m7G的水平。除此之外，研究者还发现细胞质mRNA上的m7G总体丰度大于细胞核mRNA。为了筛选mRNA内部m7G修饰的特异性识别蛋白，研究者利用体外转录技术（in vitro transcription）合成了两条仅含有G或m7G的单链寡核苷酸 (ssRNA) ，并将其与HepG2全细胞裂解液进行孵育，利用RNA pull down和质谱技术联合分析，鉴定出能特异性识别m7G-ssRNA的RNA结合蛋白。eCLIP-seq数据库分析结果表明，在QKI、IGF2BP2和LRPPRC这三个候选蛋白中，只有QKI含有与METTL1类似的GA-GA-基序（motif），正好是先前报道的mRNA内部m7G修饰基序。QKI是STAR蛋白家族的一员，主要包含QKI5、QKI6和QKI7三个亚型。细胞内（in cellulo）和细胞外（cell-free）RNA pull-down实验表明QKI5、QKI6与QKI7均倾向与含有内部m⁷G修饰的ssRNA结合。接着研究者综合分析了m7G甲基化RNA测序（MeRIP-seq）以及QKI5/QKI6/QKI7 RNA免疫共沉淀测序（RIP-seq）的数据，发现两者都具有类似的GANGAN（N=A/C/U/G）基序。此外，METTL1敲除可以显著抑制QKI与靶mRNA的结合，提示QKI与靶mRNA的结合至少部分依赖于METTL1所介导的内部m⁷G修饰。

此前的研究发现，活性氧和热应激刺激可动态调控mRNA内部m7G修饰的水平，但其背后的机制并不明确。在各种应激源的刺激下，细胞质内RNA、蛋白翻译复合物和RNA结合蛋白通过液-液相分离组装成无膜细胞器结构，称为应激颗粒（stress granule）。应激颗粒将特定的蛋白质和mRNA分子与细胞质分隔开来，对应激状态下mRNA的代谢起到了关键的调节作用。G3BP1是上述应激颗粒中RNA-蛋白互作网络中的核心调控分子。研究者通过免疫共沉淀（Co-IP）、免疫荧光和邻位连接技术（PLA）等检测方法发现QKI6和QKI7可以与G3BP1发生相互作用。在正常情况下，具有m7G修饰的mRNA分布于细胞质内；而在应激状态下，具有m7G修饰的mRNA会向应激颗粒内聚集。QKI 敲低显著降低应激颗粒内具有m7G修饰mRNA比例，野生型QKI7过表达可以大体上恢复这一表型。

上述实验结果提示，应激状态下QKI可以识别并结合具有内部m7G修饰的mRNA，通过与G3BP1发生相互作用从而将靶mRNA限制在应激颗粒内。那么，QKI将靶mRNA携带至应激颗粒之后，对其代谢有何影响呢？

为了回答这一问题，研究者综合分析了应激状态下m7G MeRIP-seq、QKI7 RIP-seq以及SG RNA-seq的数据。测序结果同样提示，具有m7G修饰并能与QKI7结合的mRNA更倾向在应激颗粒中聚集。KEGG通路分析表明这些基因多富集在“Hippo signaling pathway”和“pathway in cancer”两个通路。接下来研究者开展了mRNA稳定性测序（mRNA stability profiling）和多聚核糖体分析（Polysome profiling），实验结果表明，在应激状态下QKI可以调控Hippo 信号通路关键基因等靶基因的稳定性和翻译效率。

应激颗粒对肿瘤细胞在极端环境下的生存至关重要。长春新碱、紫杉醇、索拉菲尼等常用化疗药物均可诱导肿瘤细胞形成应激颗粒。TCGA数据库分析表明，QKI与各种应激颗粒关键基因的表达均存在显著的正相关性。研究者进一步研究发现阿霉素（doxorubicin）也可诱导肿瘤细胞形成应激颗粒，且QKI7与G3BP1共同定位于阿霉素诱导形成的应激颗粒中。体内外实验表明，QKI7过表达可显著增强肿瘤细胞对阿霉素的敏感性，提示应激颗粒对肿瘤化疗耐药的作用可能与mRNA内部m⁷G修饰有关。

综上，该研究揭示了QKI作为mRNA内部m7G修饰识别蛋白的新功能，对应激颗粒内部mRNA的调控网络提出了新的机制，并为靶向QKI/G3BP1从而优化肿瘤治疗这一新策略提供了理论依据。