蛋白质组实验流程

双向电泳的样品的制备

样品制备原则

样品制备是双向电泳中最关键的一步，将直接影响 2-DE 结果好坏。目前并没有一个通用的样品制备方法，尽管处理方法多种多样，但都遵循几个基本的原则：1）尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；2）减少对蛋白质的人为修饰；3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。

根据这一原则，样品制备需要四种主要的试剂：离液剂(chaotropes),主要包括尿素（Urea）和硫脲（thiourea）；表面活性剂（sufactants），也称去垢剂，如 CHAPS 与 Zwittergent 系列等双性离子去垢剂；还原剂（reducing agents） ，最常用的是二硫苏糖醇（DTT）和磷酸三丁酯（TBP）等。当然，也可以选择性
的加入 Tris-base,蛋白酶抑制剂以及核酸酶。

样品的来源不同，其裂解的缓冲液也各不相同。通过不同试剂的合理组合，以达到对样品蛋白的最大抽提。在对样品蛋白质提取的过程中，必须考虑到去除影响蛋白质可溶性和 2DE 重复性的物质，比如核酸、脂、多糖等大分子以及盐类小分子。大分子的存在会阻塞凝胶孔径，盐浓度过高会降低等电聚焦的电压，甚至会损坏 IPG 胶条，这样都会造成 2-DE 的失败。样品制备的失败很难通过后续工作的完善或改进获得补偿。核酸的去除可采用超声或核酸酶处理，超声处理应控制好条件，并防止产生泡沫；而加入的外源核酸酶则会出现在最终的 2D 胶上。脂类和多糖都可以通过超速离心除去。透析可以降低盐浓度，但时间太长；也可以采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。因此，样品制备方法必须根据不同的样品、所处的状态以及实验目的和要求来进行选择。目前有很多方法适于 2-DE，如组织或细胞的总蛋白提取物、亚细胞组份或细胞器蛋白、免疫沉淀的蛋白及其它亚组份蛋白（如磷酸化蛋白、采用亲合纯化凝集素结合蛋白等）。

一、细胞样品

1.细胞培养，加药与处理。

2.胰酶消化贴壁细胞，PBS 漂洗 3 次(1500ｇ，5min)，弃上清, 再次离心，去尽残液（非常重要！）。如要比较细胞膜蛋白组的差别，最好用细胞刮收获细胞。如用 10mM Tris/ 250 mM Sucrose(pH 7.0)代替 PBS，可有效降低样品的盐浓度。加入 5 倍体积裂解液，混匀（或将 1×106 细胞悬于 60～100?l 裂解液中）。

3.加 50ug/ml RNase 及 200ug/ml Dnase，在 4℃放置 15 分钟。

4.15,000 转，4℃离心 60 分钟（或 40,000 转，4℃离心 30 分钟）。

5.收集上清。

6.测定蛋白浓度(采用 BioRad RC/DC protein assay kit)。

7.分装样品，冻存于－70℃。

二、组织样品

1.碾钵碾磨组织，碾至粉末状。

2. 将适量粉末状组织转移至匀浆器，加入适量裂解液，进行匀浆。

3. 加 50ug/ml RNase 及 200ug/ml DNase，在 4℃放置 15 分钟。

4. 15,000 转，4℃离心 60 分钟（或 40,000 转，4℃离心 30 分钟）。

5. 收集上清，测定蛋白浓度。

6.分装样品，冻存于－70℃。

注意事项：

1.8 mmol/L PMSF 必须在添加还原剂之前用，否則 PMSF 会失去活性。

2. 40 mmol/L 浓度以下的 Tris 可使有些蛋白酶在高 pH 值下失活。

3. 细胞清洗――大多用 PBS，若 PBS 残留于细胞表面会造成胶上出现水平条纹 ，则可利用(10 mmol/L Tris, 250 mmol/L sucrose pH 7.0)來解決此问题。

双向电泳操作步骤

水化上样(被动上样)

1.从冰箱中取出 IPG 胶条，室温放置 10min。

2.沿水化盘槽的边缘从左向右线性加入样品，槽两端各 1cm 左右不加样，中间的样品液一定要连贯.注意：

注意：

不要产生气泡，否则会影响胶条中蛋白质的分布。

3.用镊子轻轻撕去 IPG 胶条上的保护层。

注意：

碱性端较脆弱，应小心操作。

4.将IPG 胶条胶面朝下轻轻置于水化盘中样品溶液上

注意:

不要将样品溶液弄到胶条背面,因为这些溶液不会被胶条吸收;还使胶条下面的溶液产生气泡。如产生了气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶走。

5.放置 30~45min 大部分样品被胶条吸收，沿着胶条缓慢加入矿物油，每根胶条约 3ml(17cm IPG)，防止胶条水化过程中液体蒸发。

6.置等电聚焦仪于-20℃水化 11~15h。

第一向等电聚焦

1.将纸电极置于聚焦盘的正负极上，加 ddH2O 5~8?l 润湿。

2.取出水化好的胶条，提起一端将矿物油沥干，胶面朝下，将其置于刚好润湿的滤纸片上杂交以去除表面上的不溶物。

3.将 IPG 胶条胶面朝下置于聚焦盘中，胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极，确保胶条与电极紧密接触。

4.在每根胶条上覆盖 2-3ml 矿物油。

5.对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。

6.聚焦结束的胶条，立即进行平衡、第二向 SDS-PAGE 电泳。或将胶条置于样品水化盘中，-20℃冰箱保存，电泳前取出胶条，室温放置 10 分钟，使其溶解 。

第二向SDS-PAGE

电泳

1.配制 12%的丙烯酰胺凝胶。

2.待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的 MilliQ 水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。

3.配制胶条平衡缓冲液 I

4.在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用 MilliQ 水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品，这样可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。

5.将胶条转移至样品水化盘中，加入 6ml(17cm IPG)平衡缓冲液 I，在水平摇床上缓慢摇晃 15 分钟。

6.配制胶条平衡缓冲液 II。

7.第一次平衡结束后，取出胶条将之竖在滤纸上沥去多余的液体，放入平衡缓冲液 II 中，继续在水平摇床上缓慢摇晃 15 分钟。

8.用滤纸吸去 SDS-PAGE 胶上方玻璃板间多余的液体，将二向凝胶放在桌面上，凝胶的顶部面对自己。

9.将琼脂糖封胶液加热溶解。

10. 在 100ml 量筒中加入 TGS 电泳缓冲液。

11. 第二次平衡结束后，取出胶条，用滤纸吸去多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。

12. 用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在 1×电泳缓冲液中漂洗数次。

13. 将胶条背面朝向玻璃板，轻轻放在长玻板上，加入低熔点琼脂糖封胶液。

14. 用适当厚度的胶片,轻轻地将胶条向下推,使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触.

注意:

不要在胶条下方产生气泡，应推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面 。

15. 放置 5 分钟，使低熔点琼脂糖封胶液凝固。

16. 打开二向电泳制冷仪，调温度为 15℃。

17. 将凝胶转移至电泳槽中，加入电泳缓冲液，接通电源，起始时用的低电流（5mA~10mA/gel/17cm），待样品在完全走出 IPG 胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（20-30mA/gel/17cm）待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳 。

18. 电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。

19. 进行染色。