蛋白质印迹—蛋白转膜和染色

凝胶内蛋白的显色

蛋白显色的阶段非常重要，可以知道蛋白迁移的是否均匀、平坦。如果分离后的蛋白需要转膜，就用铜染，因为考马斯蓝染色是不可逆的。 考马斯蓝染色只用来检测转移的有效性，或者蛋白不需要转膜时，只用于观测蛋白 SDS-PAGE 分离的结果。

1.a) 考马斯蓝染色

电源关闭，分离的蛋白带就会扩散，因为蛋白在溶液中是可溶的，为了防止扩散，凝胶中加入 40% 双蒸水、10% 醋酸、50% 甲醇，能使蛋 白质沉淀（变成不溶性的）。在上述溶液中加入 0.25% 考马斯亮蓝 R-250 使被固定的蛋白染色，在摇床上保持摇动，室温，4 小时至过夜。 转移凝胶至 67.5% 双蒸水、7.5% 醋酸、25% 甲醇混合物中（染料混合物保存起来，可多次重复使用）润洗，一直在摇床上震摇，中间更换 润洗液，直到洗去多余染料。染料不会结合到丙烯酰胺上，凝胶背景清晰，凝胶中的蛋白条带染成深蓝色。

2.b) 铜染法

电泳凝胶用蒸馏水清洗数秒钟（最多 30 秒），然后转移至 0.3 M CuCl2 溶液中染色 5-15 分钟，再用去离子水洗一次，在暗背景下观察，在 蓝色胶背景下蛋白出现透明条带。

将胶置于 0.1- 0.25 M Tris/0.25 M EDTA pH 8.0 缓冲液中漂洗凝胶完全脱色，根据厂家说明再置于电转缓冲液中开始转膜。

蛋白转膜

1.详细的转膜操作可以在电转仪厂家的网页上找到，不同的系统操作也有区别。蛋白从凝胶至膜的转移应用的原理是电荷在电场中的迁移。

2.转膜方式分为半干转移和湿转移两种，半干式转膜速度快，而湿式转膜不会因为膜的干燥而失败，因此成功率高并特别适合用于分子量大 于100kDa 的蛋白。两种转膜方式都是膜紧贴凝胶，位于两层吸收材料之间，固体夹板夹在外面以保证膜和凝胶的紧密接触。

3.湿式转膜中膜和凝胶的三明治结构位于滤纸和海绵体之间（海绵/纸/胶/膜/纸/海绵），全部紧密排列，特别是胶/膜之间不能留有气泡。整 个三明治结构浸泡在转移缓冲液中，然后施加电场。带负电荷的蛋白向阳极移动。但膜阻挡了它们，并与其进行结合，从而阻止了它们的 继续移动。凝胶一般在 100V 条件下运行 1~2 小时，时间和电压可以优化，我们推荐根据厂家的说明进行操作。

4.标准的湿转缓冲液和电泳缓冲液一样，为不含 SDS 的 1X Tris-gly 缓冲液，加入甲醇至终浓度 20%。如果转膜的蛋白分子量大于 80kDa， 则推荐加入 SDS 使之终浓度为 0.1%。

5.半干式转膜中，三明治结构纸/凝胶/膜/纸用转移缓冲液浸湿，直接置于电转仪的正负极之间。在进行转移时，要注意一定要使膜紧贴阳极 而胶紧贴阴极。所用的电转缓冲液中 Tris 和甘氨酸的比例不一定和湿转的相同，需参考厂家的仪器说明书。标准配方是：48mM Tris、 39mM 甘氨酸、0.04% SDS、20% 甲醇。

6.两类膜可供选择：硝酸纤维素膜和 PVDF 膜（正电荷尼龙膜）。PVDF 膜需要小心地进行前处理：剪出大小合适的膜，在甲醇中浸泡 1-2 分 钟，再孵育于冰冷的电转缓冲液中5分钟。胶也需在冰冷的电转缓冲液中平衡 3-5 分钟，否则转膜时会起皱导致条带变形。

大蛋白和小蛋白转膜时的注意事项

电转移缓冲液中 SDS 与甲醇的平衡、蛋白大小、胶浓度都会影响转膜效果，如下调整可以增加转膜效果。

大蛋白（大于100 kDa）

1.对于大蛋白而言，其在凝胶电泳分离迁移较慢，而从凝胶转出也非常慢，因此对于这种大分子量蛋白应该用低浓度的凝胶，8%

或更低， 但因低浓度的胶非常易碎，所以操作时需十分小心。

2.大蛋白易在凝胶里形成沉淀，从而影响转膜。转膜时在电转移缓冲液加入 SDS 至终浓度 0.1%，避免出现这种情况。甲醇易使

SDS 从蛋 白上脱失，因此相应降低甲醇的浓度至 10% 或更低，以防止蛋白沉淀。

3.降低电转移缓冲液中甲醇的比例，这样可以促进凝胶的膨胀，更易于大蛋白的转出。

4.只有使用硝酸纤维素膜时，甲醇才是必需的。如果是 PVDF 膜，甲醇可以不必加入电转移缓冲液中，但转膜前 PVDF 需用甲醇活化。

5.选择湿式，4℃ 转膜过夜，以取代半干式转膜。

小蛋白（小于100 kDa）

1.SDS 阻止蛋白与膜的结合，小蛋白更是如此。因此，对于小分子的蛋白，电转移缓冲液中可以不加 SDS。

2.保持 20% 的甲醇浓度对于大于 500kDa 的蛋白，请参考下述文献：

Bolt and Mahoney, High-efficiency blotting of proteins of diverse sizes following sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide,gel electrophoresis. Analytical Biochemistry

247, 185–192 (1997).

更多的转膜技巧：

避免手指直接接触膜，应使用镊子，手指上的油脂与蛋白会封闭转膜效率并易产生背景污斑。

在滤纸间排列凝胶和膜时，尽量用移液器或 15ml 试管赶除胶与膜之间的气泡，或在转移缓冲液中进行以防止气泡产生，请戴手套！

确认裁剪的膜和滤纸与凝胶尺寸相同，边缘太大会导致在进行半干式转膜时电流不能通过膜。

鸡抗体易与 PVDF 膜和其它尼龙膜结合，导致高背景，请替换成硝酸纤维素膜以降低背景。

膜上蛋白的显像：丽春红

为检测转膜是否成功，用 TBST 洗膜（TBST 溶液的配制详见 71 页缓冲液章节）。准备贮备液：2% 丽春红 S 溶于 30% 三氯乙酸和

30% 磺 基水杨酸，室温下震摇 5 分钟。1:10 稀释贮备液。

然后将膜浸泡在水中直至水变清且蛋白条带清晰。

用 TBST 或水重复洗膜直至膜完全脱色，PVDF 膜需用甲醇活化后再用 TBST 洗。

膜的封闭

有两种传统封闭液：脱脂奶粉或 BSA（Cohn 因子 V），脱脂奶粉成本低但不能用于磷酸化蛋白（因脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是 一种磷酸化蛋白，会结合磷酸化特异性抗体而易产生高背景。）

为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合，需要进行膜的封闭。

某些抗体用 BSA 封闭时可能会产生比脱脂奶粉更强的信号，请仔细阅读说明书，以确定有无特殊封闭膜方法。

用封闭缓冲液封闭 1 小时，4°C 震摇，封闭后用 TBST 洗 5 秒。

一抗的孵育

孵育缓冲液

按抗体说明书建议的稀释倍数，用 TBST 稀释一抗。如果说明书没有建议稀释倍数，则参照一般推荐的稀释倍数 (1:100-1:3000)进行预试验，根 据试验结果选择合适稀释倍数，一抗浓度过高会导致产生非特异性条带。

某些实验室传统上在封闭液中孵育抗体，而有些实验室用不含封闭剂的 TBST 来孵育抗体，结果因抗体而异，有时两者结果相同，有时结果 不同。

如果不存在高背景的问题，某些抗体用含低浓度 (0.5 – 0.25%) 脱脂奶粉或 BSA 的封闭液甚至二者都不含的封闭液来稀释，可产生相对更强的信号条带。

孵育时间

一抗的孵育时间可从几小时至过夜（一般不超过 18 小时）不等，具体取决于抗体与蛋白的亲和性和蛋白的丰度，建议使用较高的抗体稀释 倍数和较长的孵育时间来保证特异性结合。

孵育温度

如果在封闭液中孵育过夜，应在 4oC 进行，否则污染会导致蛋白降解（特别是磷酸基团）。孵育一抗时需保持适当的摇动使之均匀覆盖膜，防 止结合不均匀。

二抗的孵育

一抗孵育结束后，用 TBST 摇动洗膜数次，每次 5 分钟或更长，去除残留的一抗。

孵育缓冲液和稀释：

按说明书推荐的倍数用 TBST 稀释二抗，如果说明书没有标出稀释倍数，则按常规的倍数稀释 (1:1000- 1:20,000) 预实验，二抗的浓度过高 也会导致非特异性条带。

可以在封闭液中孵育二抗（和一抗），但可能在降低背景同时导致特异性条带的信号也减弱，可能是封闭剂阻碍了抗体与靶蛋白的结合。

孵育时间和温度：

室温振荡 1-2 小时。

标记物：推荐使用 HRP 标记二抗，不建议使用 AP（碱性磷酸酶）标记二抗，因其不够灵敏。

显色方法

检测试剂盒：

HRP 标记二抗：传统上使用 ECL 和 ECL+（自制或购买），推荐使用后者。对于新一代检测仪器例如 Genegnome，请用仪器制造商推荐的试剂盒。

我们不推荐 ECL 或 BCIP/NBT 试剂盒，因为不够灵敏。

X-ray 胶片：

传统上使用手工曝光的方法，可控制 X-ray 胶片在曝光剂和定影剂的时间。而全自动 X-ray 胶片曝光器也已经广泛使用且操作简便。

过度曝光的胶片不适合用于分析，因为不能判定相对蛋白量。

过度曝光导致全暗的背景没有反差和/或产生大量的非特异性条带。

数字图像显影：

新一代的胶片显色方法是使用数码相机在暗室中拍摄膜上的化学发光，将其转成数字信号，再通过仪器自带的软件进行分析。

一系列的数字成像仪都已经商品化。新一代数字成像仪不使用 HRP 标记抗体（即化学发光），如 STORM 分析仪只检测荧光标记二抗， Odyssey 红外线成像系统探测红外线荧光。