重组蛋白质的表达、纯化、复性和定量

按操作手册进行，具体步骤如下。

一、重组蛋白质的诱导表达

1.挑取转化有质粒的单菌落，接种于 3ml 选择性 LB 液体培养基中，37 oC，250rpm/min 振摇培养过夜。

2. 次日将培养过夜的菌液 500 μl 再接种于 10 ml（1:::20）选择性 LB 液体培养基中，37 oC，250 rpm/min 振摇培养至光密度（OD600=0.6）时，取 1 ml 样本作为诱导前标本，10000g 离心 1 min 收集菌体沉淀，－20 oC 冻存备用。

3. 加入 1 mol/L IPTG 于菌液中，使 IPTG 终浓度为 1 mM，37 oC，250 rpm/min振摇培养 4～5 小时。取 1 ml 样本作为诱导后标本，同上法收集菌体沉淀，－20 oC 冻存备用。

4. 将诱导前后菌体沉淀用 20 ~ 40 μl PBS（pH= 8.0）重悬，加入等体积的 2×SDS上样缓冲液，煮沸加热 5 min，SDS 聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离 ，考马斯亮蓝染色 3 小时后，脱色观察结果。

5. 选取诱导成功的细菌克隆，扩大诱导规模，收集菌体沉淀，于－20 oC 保 存 ，准备做下一步分析及纯化。

二、重组蛋白质的分离纯化

重组蛋白质的可溶性鉴定

1.将按上法诱导培养后收集的菌体重悬于裂解液 1 (Lysis buffer under nativeconditions )中，然后在－80 oC 低温冰箱中放置 10 min。

2. 冰中解冻。

3. 在冰浴上用超声破碎仪破菌 6 次，每次 10 sec，间歇 10 sec，电压 200-300 V。

4. 10000g，4oC，离心 20 min，取上清（为溶液 A）， －20 oC 保存；另将沉淀用同样裂解液 1 溶解（为溶液 B），同样－20 oC 保存，供后继分析使用。

5. 将上述 A、B 溶液和诱导前后的细菌进行 SDS-PAGE 电泳，考马斯亮蓝染色，比较分析重组蛋白质的溶解性。如果诱导表达的蛋白质位于 A 溶液中，则为可溶性蛋白；如果是在 B 溶液中，则为非可溶蛋白。

重组蛋白质为非可溶性蛋白（变性条件下）的分离纯化

1.将菌体沉淀溶于适量裂解液 2（Lysis buffer under denaturing conditions ）中，室温下搅拌和吹打沉淀，避免泡沫生成。

2. 10000g，4 oC，离心 30 min，收集上清液。

3. 将 Ni-NTA Agarose 充填柱子，并连接于 Pharmarcia 低压液相层析系统，用 5倍柱体积的裂解液 2 平衡 Ni-NTA Agarose，调节 A280 值至零线。

4.将适量上清液上样到 Ni-NTA Agarose 柱子中，并用 lysis buffer 冲洗至 A280值低于 0.01。

5. 分别用 5～10 倍柱体积的清洗液 1 和清洗液 2（Wash buffer 1 and 2）清洗柱子，直至 A280 值低于 0.01。

6. 用洗脱液（Elution buffer）洗脱重组蛋白质，在 A280 值监测下，收集出现峰线后含有重组蛋白的所有洗脱液。

三、重组蛋白质的复性、冻干和定量

纯化后的蛋白用梯度降低的尿素溶液缓慢透析，最终用 0.01×PBS 透析，透析后的蛋白质溶液经冻干成粉状。以牛血清白蛋白(BSA)为标准，采用 BIO-RAD 公司蛋白质定量试剂(protein assay)比色测定蛋白质的含量。