免疫沉淀-裂解物的预清除程序和免疫沉淀

一、裂解物的预清除程序

裂解物预清除可以帮助减少蛋白质非特异性结合到agarose (琼脂糖)或Sepharose beads (凝胶琼脂糖珠)。用无关抗体或血清预清除，可去除蛋白质与免疫球蛋白的非特异结合。最终实验结果背景降低并且信噪比提高。但是，如果最后蛋白质是由免疫印迹实验检测，预清除未必必要，除非是污染蛋白质对目的蛋白质产生明显干扰。

1.加入50μl 同种动物来源和型的无关抗体或正常血清作为免疫沉淀抗体（一些研究人员首选兔，参考Harlow and Lane，243 页）到1ml 裂解物中，在冰上孵育1 小时。

2.加入100μl 珠浆。

3. 4°C 孵育10-30 分钟并轻轻搅拌。

4. 微型离心机14000g 4°C 离心10 分钟。

5. 丢弃珠子并保留上清进行免疫沉淀。

为了提高收率，珠子可用裂解液洗涤1 或2 次以上，并将上清收集在一起。

重要的是要确保尽可能多的去除正常血清，这是因为它会与特异抗体竞争靶抗原。为了检查这一点，可以做一个测试：用裂解缓冲液代替样品，如上进行所有预清除步骤。考马斯蓝染色的凝胶将显示上清液中血清IgG 是否被有效去除。如果血清没有得到充分去除，泳带将出现在50 和25 kDa 处，这是重链和轻链，它的存在可能导致一个弱的免疫沉淀反应。在预清除步骤，考虑降低血清量或增加与您的样品孵育的珠子数量。

二、免疫沉淀

1.在冰上预冷离心管中加入10-50μg 含推荐量抗体的细胞裂解物。具体数量将根据蛋白质的丰度和抗体与蛋白质的亲和力来选择。

通常在预实验中，通过增加抗体的量沉淀固定数量的蛋白质。

您可以查看抗体数据表获得建议抗体的浓度。以下供参考使用：

1-5μl 多克隆抗体血清

1μg 亲和纯化的多克隆抗体

0.2-1μl 腹水（单克隆抗体）

20-100μl 培养液上清（单克隆抗体）

2. 样品和抗体孵育的固定时间4°C 1-12 小时（过夜），最好轻轻振荡或旋转。孵育时间的长短取决于蛋白质的量和抗体的亲和特性。

3. 同时准备琼脂糖珠子。如果使用单克隆抗体，选择蛋白G 偶联琼脂糖珠子。如果使用多克隆抗体，蛋白A 偶联琼脂糖珠通常是适合的（请参阅“选择蛋白珠”表9.5 下文）。如果买来的珠子是粉末，100mg 的珠子与1ml 0.1M PBS 孵育，洗1 小时后珠子膨胀起来，然后离心，去除上清。加入1ml 含0.1％ BSA (牛血清白蛋白) PBS，混合1 小时，PBS 洗涤2 次。去除上清并加入400μl 含蛋白酶抑制剂的缓冲液（可与裂解液相同）就可以使用了。它可以在4°C 储存几天；在含0.02％ 叠氮钠的PBS 里会保存更长时间（使用当天用新鲜裂解液充分洗涤珠子）。您也可以购买事先膨胀好的珠子直接使用。

(最好是用尖端切掉的移液吸头，以防破坏珠子。IgM抗体：不要使用蛋白A或蛋白G结合珠子。使用山羊抗小鼠 IgM（或多价Ig 或抗重链）的珠子。)

4. 浆料混合好，向每个样本中加入70-100μl。始终保持样品在冰上。珠子将倾向于粘着吸头，所以尽量减少珠子在吸管中运动并使用从尖端切断5mm 的吸头。

5. 裂解珠子混合液4°C 孵育4 小时并旋转振荡（最佳孵育时间可由预实验确定）。

6. 当孵育结束后，管子离心，去除上清液并用细胞裂解液洗涤珠子3 次（每次4°C 离心去除上清）。

7. 最后，去除最后一次上清并加入25-50μl 2×上样缓冲液。95-100°C 煮沸5 分钟，以变性蛋白质并将其与蛋白- A /G 珠子分离，随后离心并保持上清含有蛋白质。然后，您可以冻存样品或进行SDS – PAGE 电泳。

使用上样缓冲液是最苛刻的洗脱方法，也将洗脱任何非共价结合的抗体和抗体片段，这将显示在免疫印迹胶中。抗原可用温和的甘氨酸梯度洗脱（高达1M），以减少抗体洗脱量。