什么是PEG化，为什么它是一个重要的过程？

聚（乙二醇）（PEG）是药物递送系统中广泛使用的聚合物，并且通常直接与药物治疗剂缀合。PEG是一种水溶性、生物惰性、非免疫原性合成聚合物，由乙二醇（-CH 2-CH 2-O-）重复单元组成（图1）。PEG是通过环氧乙烷的阴离子聚合反应产生的，该聚合反应由甲氧基离子对环氧环的亲核攻击引发（图2）。蛋白质缀合物的PEG化是PEG非共价或共价连接至潜在的感兴趣的蛋白质、肽或抗体以在诸如构象、静电结合和疏水性的领域中产生大分子的理化性质的改变的过程。聚乙二醇化被用作一种策略，以克服预期用于治疗用途的候选药物的不稳定性、循环半衰期不足和免疫原性等挑战。

图1：单个PEG链的结构。	图2：通过阴离子聚合合成mPEG的机理

PEG化前的注意事项

PEG聚合物的结构和大小是在蛋白质PEG化之前考虑的重要参数。发现结合的PEG的质量对于确定其在血液中保留的时间是重要的。 PEG性质的现代改进涉及合成较少多分散的PEG产物，例如支链形式。最初，几年来使用的唯一PEG聚合物的大小为5 kDa，其在链的一部分处用甲氧基“封端”并在羟基处终止。然而，将蛋白质与这些聚合物缀合存在缺陷。一方面，这导致样品中存在显著量的二醇杂质，这导致形成共价蛋白质聚集体。另一方面，PEG聚合物内存在不同长度的侧链（高多分散性），这导致具有不同质量的缀合物产物。两者都在最终的聚乙二醇化蛋白质产物中产生异质性。为了克服这一点，在20世纪90年代，低多分散、活化、高质量支化PEG聚合物（尺寸为30- 40 kDa）进入市场。支链PEG（PEG 2）的特征在于两条PEG聚合物链连接到一个活化部分。这种聚合物形式通过允许通过修饰蛋白质中的一个氨基酸残基来连接双重聚合物，从而允许蛋白质表面的更高掩蔽，使蛋白质更具生物活性。 考虑到掩蔽蛋白质中的催化或识别位点的可能性很高，因此有必要优化连接链的数量和质量（修饰程度），以保持最大的生物活性和生物利用度。因此，PEG端基的疏水性是一个考虑因素。 谢尔曼等人，使用抗PEG抗体检测三种不同PEG类似物，叔丁氧基-PEG（tBu-PEG）、甲氧基-PEG（mPEG）和羟基-PEG（OH-PEG）的免疫原性的研究发现，在“端帽”处的体积越大（分子量越高）、疏水性越强，非免疫原性特征越大。相比之下，OH-PEG被认为对于PEG化的治疗剂更好，因为更大的侧链可能导致增加的屏蔽。

蛋白质PEG化之前的另一个重要参数是蛋白质序列内的靶向缀合。不幸的是，只有少数策略用于位点特异性缀合，例如在低pH下缀合至蛋白质的氨基末端基团。在氨基基团处的PEG-聚合物缀合通过烷基化或酰化发生。烷基化保持带正电荷的胺，而酰化产生中性酰胺，其可改变蛋白质的表面特征，这可降低蛋白质缀合物的生物利用度和活性。然而，已经发现，在赖氨酸的ε-氨基处，其具有比蛋白质α-氨基末端更高的酸解离常数（pKA），为更优先的位点特异性缀合让路，因为在低pH下，α-氨基仅具有反应性。

蛋白质与PEG结合的优势

将PEG连接到生物大分子的关键优点是：沿着PEG的1）在水溶液和有机溶液中的高溶解度，2）其亲水特性、3）其非免疫原性特性。PEG的重复侧链单元与蛋白质连接，使得它们可以在空间上屏蔽抗原表位免受免疫系统识别，因为PEG是非免疫原性聚合物。这可以帮助治疗性缀合物避免通过来自网状内皮系统的吞噬反应或蛋白水解酶的降解，所述蛋白水解酶试图去除循环和组织中的外来颗粒或可溶性物质。蛋白质与PEG的缀合可以通过PEG侧链与水分子提供的氢键增加亲水性，这增加了流体动力学体积并产生了围绕聚合物的稳定的水合壳，这可以通过结果增加结合的大分子的溶解度。这种流体动力学尺寸的增加有助于在肾脏中产生对肾过滤的阻力，导致药物缀合物的清除发生得更慢。

Enzo该试剂盒适用于药物开发和制药应用，包括药物配方、药代动力学分析、药物比较、候选药物鉴别、批放行标准和过程中QC研究。该试剂盒也已被验证用于定量复杂生物基质中的聚乙二醇化靶分子，扩展了其用于监测药物水平或其在组织中积累的实用性。该测定法可测量1 ng/ml的PEG化分子，并对各种分子量的线性和支化PEG（游离形式和蛋白质结合物）进行了验证（图3）。该试剂盒能够在2小时内一式两份分析多达35个样品，适合快速、高通量分析。通过在单次试验中测定两种含PEG-BSA的缓冲液对照品的16份重复样品，确定试验内精密度。图4显示，在开发过程中，该ELISA报告了3.4 - 4.2%的低试验内%CV范围。另一方面，通过反算几天内多次试验中产生的16条标准曲线中的3份标准品，确定试验间精密度。图5显示，在产品开发中，该ELISA报告了1.3 - 5.7%之间的低试验间%CV范围。聚乙二醇化ELISA试剂盒是一种具有高标准重现性的高精度试剂盒。

图3：PEG化蛋白ELISA试剂盒的特异性。	图4：PEG化蛋白ELISA试剂盒的试验内精密度。	图5：PEG化蛋白ELISA试剂盒的试验间精密度。

用PEG缀合蛋白质的缺点

PEG是最常用的聚合物，并且用作将PEG缀合至药物候选物的基于聚合物的药物递送系统的金标准。已经发现作为药物候选物的潜在化学先导物的PEG化是期望的，因为它增加了保留时间，降低了免疫原性并增加了待被酶代谢的药物的稳定性。已从代谢的聚乙二醇化治疗剂在各种组织中的积累中发现了可能的副作用和并发症，因此聚乙二醇化产物的影响的检查一直是表征超敏反应、药代动力学行为的意外变化、毒性和来自它们的机械应力降解的拮抗作用的焦点。测定PEG化取代基的浓度可以是药物开发应用的有用工具，例如药代动力学分析、药物比较、先导候选物鉴定、批放行标准和过程中QC研究。

图6：我们的PEG化蛋白ELISA试剂盒的灵敏度。

除了Enzo的PEG化ELISA试剂盒提供的高重现性外，它还提供了一种高灵敏度的免疫测定法，检测限小于1 ng/ml，动态范围为1.75 ng/ml至225 ng/ml。该测定的灵敏度取决于检测的PEG的分子量和与靶分子缀合的PEG分子的量，并使用相对于BSA以1、3、5、10和15倍摩尔过量提供的10 kDa线性PEG评价制备的缀合物（图6）。