PCR

实验室常用 DNA 聚合酶有三种： TaKaRa TaqTM，TaKaRa EXTaqTM 和Pyrobest TMDNA Polymerase。TaKaRa TaqTM 是一般的 DNA 聚合酶，保真性较差 ，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。TaKaRa EXTaqTM是具有 Proof reading活性的耐热性 DNA 聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的 PCR 产物 3’端附有一个 “A”碱基，如果希望直接将产物克隆 到 T-vector 可以用此酶。Pyrobest TM DNA Polymerase 也是具有 Proof reading 活性的耐热性 DNA 聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的 PCR 产物为平滑末端。如果进行基因的扩增请使用此酶。

1.按下列组成在 PCR 反应管中调制反应液：TaKaRa TaqTM或 TaKaRa EXTaqTM的配方

① 反应总体积根据实际情况进行调控，可以做 20~50?l 以节约试剂；

② 将上表各成分加入到 0.2ml 或 0.5ml 灭菌的 PCR 薄壁管中；

③ 如果不用 PCR 仪的加热盖，在反应混合液的上层加 30 ~50?l 的矿物油防止样品在 PCR 的过程中蒸发；

2. 按以下程序进行 PCR 扩增。

PCR 反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异，在实际操作中需根据具体的情况以及 PCR 结果而进行优化。

反应结束后，抽取扩增样品 5ul，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用DNA marker 判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。