免疫沉淀-选择合适的微珠和使抗体与微珠交联的步骤

选择合适的微珠，汇总表

Key: +++ = Strong binding, ++ = Medium binding, + = Weak binding, - = No binding

参考资料

Harlow, Ed, and David Lane. Using Antibodies. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.Bonifacino, Juan S. et al. Current Protocols in Immunology 8.3.1-8.3.28, New York: John Wiley, 2001.

使抗体与微珠交联的步骤：

降低洗脱蛋白质溶液中污染的抗体数量：

为了使洗脱蛋白较少污染抗体，也为了更纯净蛋白质的制备和干净的免疫印迹实验，推荐将抗体与珠子交联。下面是一个实验程序举例（几个网站有关于这个程序有很多信息）。目标蛋白应该用温和的洗脱液洗脱，如甘氨酸缓冲液。更详细的缓冲液配方可在缓冲液章节找到，第71页。

试剂：

交联试剂：

邻苯二甲酸二甲酯（DMP）

储液浓度13mg/ml

洗脱试剂：

1M 甘氨酸（加浓盐酸调整pH 值至3）

稀释缓冲液：

PBS+ 1mg BSA 每1ml PBS

洗涤缓冲液：

含0.2M 三乙醇胺的PBS（每100ml 缓冲液中含3.04ml 三乙醇胺）

淬灭缓冲液：

含50mM 乙醇胺的PBS（311.7μl/100ml）

准备工作：

1.珠子用PBS 洗2 次。最终浓度为50％ 珠浆。

2. PBS 混合均匀并4°C 旋转过夜。

交联：

1.微量离心机（14000rpm 1分钟）离心沉淀以洗涤珠颗粒。吸出PBS 上清液。

2. 1:1 比例加入稀释缓冲液，轻轻混合并4°C 旋转10 分钟。微型离心机离心并如上吸出/摒弃上清。

3. 按需要的浓度用抗体稀释缓冲液准备抗体溶液（参见抗体说明书的建议浓度）。1:1 比例将抗体加入，轻轻混合并4°C 旋转1 小时。

4. 离心并吸出/摒弃上清。

5. 1:1 的比例将稀释缓冲液加入，4°C 旋转5 分钟。离心并吸出/摒弃上清液。

6. 1:1 的比例将PBS 加入，离心并吸出/摒弃上清液。

7.交联：

用1ml 洗涤缓冲液，溶解1ml 准备好的13mg/ml DMP 储液。迅速漩涡震荡混合。1:1 的比例将DMP 溶液加入，室温（RT）旋转30 分钟。

（DMP 在水溶液中不稳定。使用前快速配制。）

注意：您需要确认DMP 在加入珠子前后的pH 值均在8-9 之间（在此pH 值范围以外，交联效率将大大降低）。

用洗涤缓冲液洗涤珠子（室温旋转5 分钟，离心并吸出/摒弃上清液）。

1:1 比例第二次加入DMP，室温旋转30 分钟，按之前方法洗涤。

1:1 比例第三次加入DMP，室温旋转30 分钟，按之前方法洗涤。

7. 淬灭和洗涤。

1:1比例加入淬灭缓冲液，室温旋转5 分钟，离心并吸出/摒弃上清液；重复该步骤。用PBS 洗。

8. 去除多余的（未交联）抗体：

用1M 甘氨酸（pH3）洗涤。室温旋转10 分钟，离心并吸出/摒弃上清液；重复该步骤。

9. 存储洗涤。

用免疫沉淀缓冲液洗涤（通常是PBS+吐温）。室温旋转5 分钟。洗三次，最后一次旋转后保存。珠子可以在4°C 储存几天。可以加入0.02 - 0.05％ 叠氮钠W/V 防止细菌生长。

免疫沉淀：

结合抗体的珠子现在可以进行如上常规IP 实验流程。为了防止抗体与目标蛋白质一起洗脱，用温和的甘氨酸梯度洗脱（可到1M）。