《Nature》：揭示MapSPARTA的活化机理

Argonaute蛋白在进化过程中演变出了各种亚科蛋白。这些亚科蛋白可以识别各种不同类型的小RNA分子，从而在各种小RNA沉默途径中发挥作用。在经典的由siRNA分子介导的RNAi途径中，Argonaute蛋白可以用内切核酸酶活性来沉默mRNA靶分子，这种过程被称作切割。在生殖细胞中，面对各种外来的遗传物质，Argonaute亚科蛋白PIWI蛋白在piRNA介导的RNA沉默途径中，利用的也是切割机制。

在真核生物Ago (eAgo)蛋白，Argonaute (Ago)蛋白可以结合非编码的小RNA，参与降解或者抑制互补配对的靶向RNA，从而影响基因表达，称之为RNA干扰 (RNAi)【2】。揭示RNA干扰机理的两位美国科学家获得了2006年的诺贝尔生理医学奖。所有的eAgo都具有非常保守的结构功能域，主要由N-结构域（结合与分离靶向链），PAZ结构域（结合引导链的3’末端），MID结构域（结合引导链的5’末端）和PIWI结构域（核酸酶催化中心所在）组成。

细菌Ago（pAgo）蛋白主要分为长pAgo和短pAgo蛋白。其中，研究较多的长pAgo结构域和eAgo结构域非常相似，主要使用RNA或者DNA作为靶向序列参与清除入侵的核酸（噬菌体或质粒）或解除基因组连接。而占已知pAgo大多数的短pAgo的研究较少。短pAgo只编码MID结构域和PIWI结构域，并且其PIWI结构域没有核酸酶催化中心，不能降解结合的核酸。但是短pAgo通常与一个伴侣蛋白形成异源复合物发挥功能。长久以来，细菌中的短pAgo（约占Ago家族58%）如何发挥作用以及怎么发挥作用是领域内亟待解决的重大问题【3】。

这一领域的第一个突破性发现来自荷兰瓦赫宁根大学的Daan C. Swarts团队。2022年，他们研究了一种短pAgo与伴侣蛋白（TIR-APAZ）组成的异源二聚系统MapSPARTA。当细菌遭受外源质粒侵袭后，MapSPARTA被激活，在单链RNA引导下结合靶向单链DNA后，MapSPARTA可以形成四聚体，从而激活伴侣蛋白中的TIR结构域的NAD(P)+酶活性，进而消耗细菌体内的NAD(P)+。因为NADP是维持细菌生存必需的小分子，NADP的耗竭将会导致细菌死亡。这样，通过牺牲侵染细菌个体达到保护群体的效果【4】。Swarts团队的发现未能揭示MapSPARTA的结构和活化机理。

2023年7月26日，来自俄亥俄州立大学的傅天民团队，在Nature以加速出版形式发表论文Oligomerization-mediated activation of a short prokaryotic Argonaute，他们利用冷冻电镜和生物化学手段，完整揭示了的MapSPARTA活化机理。

在文中，作者捕捉到一系列高分辨率的MapSPARTA构象，包括未激活状态下的MapSPARTA单体结构，结合引导RNA链和靶向DNA链后的单体结构，MapSPARTA二聚化的中间态结构，四聚化的活化态的MapSPARTA，以及四聚体与NAD+的复合物，完整呈现了MapSPARTA独特的层级激活分子机制。鉴于Ago蛋白在众多生物体中的广泛存在，研究清楚MapSPARTA的作用机制，不仅有助于理解短pAgo的生物学功能和分子作用机制，也为改造pAgo奠定了基础。具体研究内容如下：

1)解析了分辨率为3.1 ?的未激活状态下的MapSPARTA单体结构，阐明了单体的基本结构组成，以及各个结构域的相互作用。

2)与其他Ago相比，MapSPARTA独特的APAZ结构域有一个C末端基序，这个C末端基序占据核酸结合口袋，起到抑制了核酸结合的功能。

3)阐明了MapSPARTA识别RNA引导链和DNA靶向链的分子基础。与其他Ago相比，短的pAgoMID结构域中特别存在的两个Loop，导致RNA引导链和DNA靶向链从第三位才开始互补配对。

4)解析了分辨率为2.7 ?的活化状态下的四聚体MapSPARTA结构，结构像一个美丽的蝴蝶。四聚体中存在两类相互作用：一类通过两个MID-MID结构域介导；另一类则是通过4个TIR结构域形成聚集体来实现的。四个MapSPARTA形成一个不对称的四聚体。四个SPARTA分子有两种不同的状态，两种状态下的TIR结构域有大约180度的翻转。

5)TIR四聚体中有两种相互作用界面：二聚化作用界面和四聚化作用界面。TIR结构域可以催化NAD降解，研究表明NAD+分子结合在TIR结构域两个二聚化作用界面上。进一步生化分析发现四聚体对于TIR的催化是必要的。

6)本文捕捉到了MapSPARTA未激活结构，结合核酸的单体结构，结合核酸的二聚体结构， 以及活化的四聚体结构，这一系列结构揭示了MapSPARTA的层级激活机理。未激活状态下的MapSPARTA单体结合RNA引导链/DNA靶向链后，MID结构域发生构象变化。接着，两个结合互补核酸链的MapSPARTA单体相互靠近后，由于MID形状和电荷的互补，MID结构域和另一个MID结构域发生相互作用，形成一个对称的二聚体。在对称二聚体中，APAZ连接的TIR结构域由于电荷和形状的互斥反应，其中一个TIR结构域发生近约180度的翻转，形成不对称二聚体。最后两个不对称二聚化的MapSPARTA再通过TIR相互作用变为四聚化激活状态。

图1. MapSPARTA的图示激活过程

综上，本研究首次从分子水平上描述了短pAgo家族MapSPARTA的激活机制，为理解其他短Ago活化机理奠定了基础，也为进一步改造MapSPARTA成为核酸检测或治疗工具提供了理论支持。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-023-06456-z

参考文献：

1.Swarts, D. C. et al. The evolutionary journey of Argonaute proteins. Nat Struct Mol Biol 21, 743-753, doi:10.1038/nsmb.2879 (2014).

2.Peters, L. & Meister, G. Argonaute proteins: mediators of RNA silencing. Mol Cell 26, 611-623, doi:10.1016/j.molcel.2007.05.001 (2007).

3.Lisitskaya, L., Aravin, A. A. & Kulbachinskiy, A. DNA interference and beyond: structure and functions of prokaryotic Argonaute proteins. Nat Commun 9, 5165, doi:10.1038/s41467-018-07449-7 (2018).

4.Koopal, B. et al. Short prokaryotic Argonaute systems trigger cell death upon detection of invading DNA. Cell 185, 1471-1486 e1419, doi:10.1016/j.cell.2022.03.012 (2022).