人肿瘤抗原的识别与鉴定 —免疫沉淀实验流程

一、裂解细胞

1．收集细胞。将培养瓶置于冰上，倒掉培养基，用PBS 或生理盐水漂洗两次，留适量液体于瓶内，然后用特制的细胞刮棒朝一个方向刮取细胞。将细胞悬液转移到离心管，离心取沉淀，-800C 保存。（收集细胞要迅 速 ，低温下进行，以减弱蛋白酶的作用）

2．裂解细胞。采用 RIPA 裂解体系，使用前 40C 预冷，按 107 个细胞加入1.0ml 裂解液，吹打混匀，加入适量的蛋白酶抑制剂（如 cocktail），冰 上放置 3~5 分钟。

3．超声处理裂解液。使用探针型超声进行多次适当频率的短促冲击，10~20秒/次，重复 3 次，中间间隔 10~20 秒，冰浴下进行。

4．15,000rpm，40C 离心 15min，吸取上清液于另一 Ep 管中，置冰上。上清液用于下一步的预处理。

二、裂解物的预处理

使用正常人的血清对裂解物进行预处理。

1、按 1ml 裂解物加 2?l 对照血清的比例加入正常人血清。

2、室温孵育 2~3 小时，缓慢摇动。

三、免疫复合物的纯化

1)用 Dynabeads proteinA 进行免疫复合物的纯化。

2)将 Dynabeads proteinA 振荡混匀，吸取 100?l 磁珠于 Ep 管中，置于磁铁架（Dynal MPC）上，磁珠吸附到管壁上，弃上清。

3)加 500?l 0.1M Na-phosphate (pH 8.1 )至 Ep 管，轻柔搓动管子约 2~3min，将Ep 管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清。

4)重复 2 步骤两次。

5)清洗完磁珠后，加 500?l 预处理后的裂解物，反复摇动管子，室温下反应10~20min。

6)将 Ep 管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，将上清转移至另一 Ep 管中。

7)用 RIPA 裂解液清洗磁珠 3 次。

8)洗脱抗原-抗体复合物。加 0.1M citrate (pH3.1) 30?l 于 Ep 管中，轻柔搓动管子约 2~3min，将 Ep 管置于磁铁架上，吸取上清于一 Ep 管。

9)重复步骤 7，将上清收集于同一个 Ep 管洗脱样品总体积为 60?l，作对照用。

10) 磁珠用 0.1M Na-phosphate (pH 8.1 ) 清洗三次后备用。

11) 在步骤 5 留取的上清中加入病人血清（1ml 加 2?l 血清），缓慢摇动，室温孵育 2~3h。

12) 将 Ep 管置于磁铁架上，磁珠吸附到管壁上，弃上清。

13) 重复步骤 6~8。共收集到两份样品,对照与病人的纯化免疫复合物各 60?l。

14) 磁珠用 0.1M Na-phosphate (pH 8.1 ) 清洗三次后加入柱储液 100?l,40C 保存。

15) 在样品中加入 2×SDS 上样缓冲液并用 1M NaOH 调节 pH 至使溴酚蓝呈蓝色。

四、1DSDS-PAGE

用免疫沉淀后的样品可直接进行一维凝胶电泳，或者对磁珠上的蛋白 A 或蛋白 G 进行耦联剂修饰，洗脱后的样品可进行 Western Blot。

RIPA裂解液：

150mmol/L NaCl；1.0%NP-40；0.5%脱氧胆酸钠；0.1%SDS；

50mmol/L Tris，（ pH 8.0）