组织病理技术/免疫组化染色

组织病理技术

组织处理：

1.取新鲜组织厚度不超过 5mm，10% 中性福尔马林固定，大于 24 小时。

2.固定后冲水 12-24 小时，

3.75%酒精，1 次，1 小时，

4.85%酒精，1 次，1 小时，

5.95%酒精，3 次，1 小时，

6.100%酒精，3 次，1 小时，

7.二甲苯，2 次，1 小时，

8.石蜡浸泡，3 次，2 小时，

HE染色：{水化}

1.二甲苯，2 次，5-10 分钟，

2.100%酒精，1 次，1-2分钟，

3.95%酒精，1 次，1-2分钟，

4.85%酒精，1 次，1-2分钟，

5.75%酒精，1 次，1-2分钟，

6.过蒸馏水，

{染色}

1.Mayer 氏苏木素，1分钟，

2.温水冲洗，5-10 分钟，

3.75% 盐酸酒精， 1-2分钟，

4.自来水冲洗，30秒钟，

5.依红复染，1-2分钟，

6.自来水洗，30秒钟，

7.85%酒精，1 次，1-2分钟，

8.95%酒精，2 次，1-2分钟，

9.100%酒精，2 次，1-2分钟，

10. 二甲苯，2 次，5-10 分钟，

11. 中性树胶封片。

免疫组化染色

一．石蜡切片免疫组化染色实验步骤：

1、石蜡切片脱蜡至水：（石蜡切片染色前应置 60℃ 1 小时）。

（1）二甲苯?、II,各 10 分钟。

（2）梯度酒精：100%，2 分钟? 95%，2 分钟? 80%，2 分钟? 70%2 分钟。

（3）蒸馏水洗：5 分钟，2 次（置于摇床）。

2．过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2，室温 10 分钟（避光）。

3．蒸馏水洗：5 分钟，2 次（置于摇床）。

4．抗原修复：根据待检测的抗原，选择适当的方法。附：抗原修复液（10mM pH 6.0 枸橼酸钠缓冲液）的配制

（1）储备液的配制：

A 液：枸橼酸三钠-2H2O 29.41g + 蒸馏水 1000ml

B 液：枸橼酸 21g + 蒸馏水 1000ml

（2）工作液的配制：A 液 82ml + B 液 18ml + 蒸馏水 900ml

抗原修复的方法：

（1）高压锅处理技术：枸橼酸钠缓冲液（10mM，PH6.0）,淹没切片,盖上锅盖，高压锅内煮沸,上汽 3 分钟后缓慢冷却（可用自来水在高压锅外冲，以助冷却）。

（2）微波处理技术:用塑料切片架,置于塑料或耐温玻璃容器内，枸橼酸钠缓冲液淹没切片，选择中高或高档,5 分钟;取出并补充已预热的枸橼酸钠缓冲液；再选择中高或高档,5 分钟.（最佳温度为 92?95℃）

（3）酶消化处理：此略。

抗原修复的注意事项

（1）组织不能干。

（2）选择抗原修复方法要因抗体而异。

（3）该方法主要用于 10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。

（4）抗原修复后至 DAB 显色的过程中，均需用 PBS 缓冲液。

5．PBS：5 分钟，2 次（置于摇床）。

6．正常血清封闭：

从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分（保持组织呈湿润状态）,滴加正常山羊或兔血清（与第二抗体同源动物血清）处理，37℃，15 分钟。附：正常血清配制 (或按试剂盒规定的浓度配制)按 1:20 比例,用 PBS 配制,每张切片需要量按 50?l+5?l (10%抛洒量)计 算 。

7．滴加第一抗体：

用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体，37℃ 2 小时（也可置于 4℃冰箱过夜）。

8．PBS：5 分钟，2 次（置于摇床）。

9．滴加生物素化的二抗，37℃，40 分钟。

10．PBS：5 分钟，2 次（置于摇床）。

11．滴加三抗（SAB复合物），37℃，40 分钟。

12．PBS：5 分钟，2 次（置于摇床）。

13．DAB显色，镜下观察，适时终止（自来水冲终止）。附：DAB 的配制

（1）储备液(DAB 25mg/ml)的配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待完全溶解后分装成 1ml,100?l,50，20l 等，—20℃，冻存。（2）工作液：DAB 储备液 20?l + PBS 1000?l + 3% H2O25

14．自来水（细水）充分冲洗。

15．苏木素复染，室温，30 秒，自来水冲洗。

16．自来水冲洗返蓝，15 分钟。

17．梯度酒精脱水：80%，2 分钟 ? 95%，2 分钟 ? 100%，2 次，5 分钟。

18．二甲苯透明：I，II（二甲苯）各 5 分钟

19．封片：加拿大树胶（或中性树胶）封片。

二．细胞爬片的免疫组化染色：

1.取出细胞爬片，迅速置入冷丙酮固定 20??30 分钟。

2.蒸馏水浸泡 5 分钟，2 次。

3.打孔液浸泡 5 分钟。

4.蒸馏水浸泡 5 分钟，2 次。

5.后接前述实验步骤的第 6 步（正常血清封闭）。

注：第 3、4 步仅用于检测细胞内抗原，检测细胞膜抗原时不用。

三．冰冻切片的免疫组化染色：

1.新鲜组织立即在恒冷冰冻切片机内切片(也可-80℃保存),厚度为 5～6m。

2.载玻片可不打底，裱片后，立即用电吹风吹干。

3.如不马上染色，可密封后-20℃保存。

4.染色前用冷丙酮在 4℃固定 10-20 分钟。

5.PBS 洗 2 次,每次 5 分钟,(必要时应用 0.1%柠檬酸钠+0.1%triton 打孔)

6.3% H2o2 灭活内源性过氧化物酶,20 分钟,避光;

7.用 PBS 洗 2 次,每次 5 分钟;

8.接前面实验步骤第六步.

四．切片的预处理：

1.洗衣粉液浸泡 30 分钟，冲洗，晾干。

2.洗液 （含强酸、高锰酸钾等）浸泡 24 小时，冲洗，晾干。

3.APES（1:50 丙酮溶液） 10-20 秒（注意：不能用塑料容器及塑料切片架）。

4.纯丙酮 I，约 10 秒。纯丙酮 II，约 5 秒

5.晾干或烤箱内烤干，备用。