免疫沉淀-用DMP 如何把抗IgM 抗体与蛋白A 或G 涂层的珠子耦合

此方法涉及抗IgM 抗体的IgG 耦联蛋白A 或G 珠子（方法见下文）。这些珠子就可以在常规免疫共沉淀程序中使用IgM 抗体。通过结合抗-IgM 抗体，IgM 可以间接结合珠子。
下面的过程介绍了用DMP 如何把抗IgM 抗体与蛋白A 或G 涂层的珠子耦合：

试剂：

200mM 硼酸盐缓冲液+ 3M 氯化钠pH 值9.0

含20mM（DMP）的200mM 硼酸缓冲液+ 3M 氯化钠，pH 值9.0

200mM 乙醇胺pH 值8.0（乙醇胺储液1:80 稀释）

磷酸盐缓冲液（PBS）

PBS+ 0.1％ 叠氮化钠

200mM 甘氨酸pH 值2.5

蛋白A 或G 珠子（Sepharose）

方法：

我们建议每ml 湿珠子使用每2mg 抗体（使用适当的抗体/蛋白A 或G 结合物）。

1.使用前1 小时将250mg 蛋白A 或G Sepharose（珠子）加入2ml PBS+0.1％ 叠氮钠。这使得珠子膨胀。

2. 将珠子与适当浓度的抗体室温混合2 小时（旋转或滚动）。

3. 2500rpm 离心5 分钟。

4. 10 倍体积200mM 硼酸缓冲液+ 3M 氯化钠洗珠子两次。

5. 20mM DMP 重悬珠子。

6. 室温旋转/振荡珠子30 分钟。

7. 将珠子2500rpm 离心5 分钟。

8. 200mM 硼酸盐缓冲液+ 3M 氯化钠洗珠子2 次。

9. 20mM 乙醇胺洗珠子1 次。这步终止耦合反应。

10. 20mM 乙醇胺重悬珠子并室温旋转2 小时。

11. 将珠子2500rpm 离心5 分钟。

12. PBS 洗珠子2 次。

13. 200mM 甘氨酸洗珠子2 次。

14. PBS 洗珠子2 次。

15. 珠子可以4°C 储存在PBS + 0.1％ 叠氮钠溶液里（PBS︰珠=1:1）。

16. 这些珠子可用于IgM 抗体的免疫沉淀实验。从这里就可以按照我们前面描述的免疫沉淀实验方法继续进行免疫沉淀程序了。