感受态细胞的制备

1.挑取适当菌株的 E.coli 单菌落接种于 2ml SOB 培养液中，37℃摇床过夜。

2. 取 0.5-1ml 过夜培养的菌液转种到 50ml SOB 中，18℃剧烈震荡，直到 A600达到 0.6。

3. 将培养物转移到 50ml 离心管中，4℃ 4,000rpm/min 离心 10min。同时在冰浴上配置 TB 溶液。

4. 弃上清，将离心管倒置于滤纸上，使培养液被吸干。

5. 取 1ml 刚配的 TB 溶液打散菌体沉淀，再加入 15ml TB（1/3 体积的起始培养液），冰浴 10-15min，4℃ 4,000rpm/min 离心 10min。

6. 弃上清，沉淀重悬于 4ml TB（1/12.5 体积的起始培养液），冰浴 10min。

7. 加入 280ul DMSO，缓缓滴入并轻轻摇晃，使其充分混合均匀，冰浴 10min。

8. 将菌液分装于 EP 管中，-80℃或液氮冻存。

9. 取两管感受态细胞分别加入 1μl无菌 ddH2O（阴性对照）和 1μl纯质粒（阳性对照）进行转化（见后），以检测感受态的质量。阴性对照平板上应该无菌落生长，阳性对照平板上菌落数目的多少显示感受态效率的高低。

0.1MK-Pipes(pH6.7)的配制

称取 3.02g Pipes 粉末溶于 80ml dd H2O 中，此时粉末不能完全溶解，用 10NKOH 或 KOH 固体调节 PH 值，只有当 PH 接近 6.7 时粉末才能完全溶解，此时当小心少量地加入 KOH 直至达到所需 PH 值。