染色质免疫沉淀—ChIP 疑难解答

无特异性抗体对照时出现背景过高

与蛋白A 或G 非特异性结合

应采用预清除处理，即在加入抗体前，将裂解的样本与磁珠混合1小时然后分离使用。

染色质免疫沉淀所用缓冲液被污染

裂解液和洗涤缓冲液要新鲜配制。

某些蛋白A 或G 磁珠本身会产生很高的背景

某些蛋白A 或G 磁珠会有很高的背景。要找到一个合适的供应商，所提供的产品应在非特异性对照样本中得到背景最低最干净的结果。

结合区域过大使得背景过高分辨率过低

片段过大

针对不同的细胞系，应优化DNA 片段的大小。超声时间和酶孵育时间均应调整。建议DNA 片段不要超过1.5kbp。如果用酶消化染色质，会得到175bp 大小的单核苷酸酶。

信号过低

染色质片段过小

要得到小于500bp 的染色质片段时，不需进行超声处理。太小的片段会使核小体被误认为核小体间的DNA 而被消化掉。如果进行末端染色质免疫沉淀，通常酶消化法即能得到所需大小的染色质片段。

交联染色质免疫沉淀时交联时间过长

用甲醛交联10-15 分钟，然后用磷酸盐缓冲液洗净，接着需要加入甘氨酸以终止甲醛的作用。过度交联可能会降低表位的可结合度从而减少抗体的结合。

原材料不足

建议每个免疫沉淀反应用25μg 染色质

免疫沉淀中抗体不足

建议开始时加入抗体量为3-5μg。如果未检测到信号，可增加抗体量至10μg。

特异性抗体结合受阻碍

在洗涤缓冲液里氯化钠浓度不要高于500mM，否则浓度过高将阻碍特异性抗体结合

细胞裂解不充分

建议用RIPA 缓冲液来裂解细胞

目标区域无足够的抗体

目标区域无表位。应有阳性对照抗体，以确认操作过程无误，如H3K4me3 用于活化的启动子，或者H3K9me3 抗体用于异染色质位点。

有些单抗不适合做交联染色质免疫沉淀

单抗识别的表位可能会在交联过程中被掩盖，而阻碍位点识别。建议用多克隆抗体，可识别多个表位，这样就增加了免疫沉淀目标蛋白的几率。

用错了抗体亲和性磁珠

蛋白A 和G 是细菌来源蛋白质，其对不同种的免疫球蛋白的亲和性不同。请使用特异性的亲和基质。建议使用混合好的蛋白A 和蛋白G 琼脂糖。

免疫沉淀DNA 时PCR 扩增的问题

反应后包括无模板的阴性对照在内均出现很高的信号

实时PCR 所用试剂被污染。建议使用储备液来新鲜配制溶液。

样本中无DNA 扩增

使用标准对照/抽样DNA 以确定样本中引物均有效。