AAV9在成年家猫中传递AMH转基因，导致猫猫完全不育

哈佛大学医学院David Pépin和美国濒危野生动物保护与研究中心William F. Swanson的研究证据表明，用腺病毒（AAV）载体传递一种AMH转基因进行单一的肌肉注射（IM）治疗，可对家猫产生长期的避孕效果。对治疗后的家猫进行了两年多的随访，在此期间监测转基因表达、抗转基因抗体和生殖激素。在两次交配研究中测量了交配行为和繁殖成功。此外，AMH的异位表达不会损害性类固醇或发情循环，但会阻止繁殖诱导的排卵，从而导致母猫安全持久的避孕。在本研究中使用了AAV9在成年家猫中传递AMH转基因（称为fcMISv2）。结果表明，这种避孕措施可以防止繁殖诱导的排卵，导致完全不育，并可能构成一种安全和持久的策略来控制家猫的繁殖。

相关研究内容以题为“Durable contraception in the female domestic cat using viral-vectored delivery of a feline anti-Müllerian hormone transgene”的论文近期发表在《Nature Communications》上。

图1 猫特异性AMH转基因的克隆及小鼠AAV9- fcMISv2的验证

本研究利用猫基因组8.0版不完整AMH序列构建了第一代猫转基因fcMISv1，为了将AMH载体避孕适应于家猫。用食肉动物的一致序列填补了AMH序列中的空白。随后，基于家猫基因组中AMH序列完整的9.0版本，获得了第二代猫AMH转基因fcMISv2（图1a）。纯化和酶裂解的FLAG-fcMISv1和FLAG-fcMISv2都能在胎鼠泌尿生殖嵴生物测定中诱导Müllerian管的消退（图1b）。AAV9治疗后一个月，发现AMH蛋白在一些组织中表达，包括四头肌和腹壁肌肉，腹膜器官如肾、脾、胰腺和肝脏（图1c），在这些地方AMH蛋白被内源性蛋白酶有效地切割，导致血液中的水平高于生理水平（图1d）。治疗4周后，用AAV9-fcMISv2 5e12 vg/kg或AAV9-fcMISv21e13 vg/kg处理的小鼠卵巢小于AAV9-empty 5e12 vp/kg组小鼠（图1e)。与对照组相比，AAV9-fcMISv2处理小鼠的卵巢原发性、继发性和有腔卵泡显著减少（图1f）。

图2 家猫注射AAV9-fcMISv2的时间线和安全性研究

用AAV9-fcMISv2 (5e12 vg/kg，低剂量；1e13 vg/kg，高剂量）或AAV9-empty 5e12 vp/kg，对照；图2a）治疗9只猫（每组3只）。采用q-PCR方法检测体液中病毒的脱落情况发现，在第2天的血液中很容易被检测到病毒基因组，并在2个月内保持升高，然后在3-4个月期间迅速下降，这可能反映了受感染细胞的更替（图2b）。在第1天的尿液中可检测到病毒脱落，并在7天内稳步下降，而口腔拭子和粪便样本的测量结果在个体和组间差异更大。利用纯化的重组FLAG-fcMISv2蛋白，开发了一种直接抗原-抗体捕获ELISA，用于检测家猫血清中的抗fcMISv2IgG（图2c）。在给予AAV9-fcMISv2载体的6只猫中均未检测到抗fcMISv2抗体（图2d）。为了评估AAV9-fcMISv2治疗的避孕潜力，在治疗后8个月和20个月的时间点启动了两个为期4个月的交配试验（图2a），在这两项试验中，对照组每窝生下2-4只健康的小猫；而经AAV9-fcMISv2治疗的猫没有在试验中分娩，在每周超声检查中也未观察到妊娠囊或胎儿。

图3 家猫注射AAV9-fcMISv2后的生殖激素

血清中循环AMH水平稳定，在第一年逐渐下降，最终在第二年达到稳定水平（图3a）。实验中没有观察到AAV9-fcMISv2治疗后猫的抑制素B显著下降（图3b），这表明窦前和早期窦前卵泡激素可能不受超出生理水平AMH的影响。可能是由于有规律的发情周期，对照组和高剂量AAV9-fcMISv2组在治疗后均出现雌二醇（E2）粪便排泄显著升高（图3c）。所有组在治疗前和治疗后的发情期频率没有观察到差异（图3d），表明E2的循环窦卵泡分泌不受超出生理水平AMH的影响。与过渡期相比，经低、高剂量AAV9-fcMISv2治疗后的猫促黄体生成素（LH）水平升高，但对照组没有升高（图3e）。治疗后，低、高剂量组的平均孕酮那个（P4）浓度均显著降低，而对照组在治疗前和治疗后组之间没有差异（图3f）。这些结果表明，接受AAV9-fcMISv2治疗的猫存在轻度高促性腺激素性性腺功能减退表型，P4降低，LH升高。高剂量AAV9-fcMISv2组的黄体周期频率显著降低，但在低剂量组或对照组中没有（图3g)。综上，这些结果表明，超出生理水平的AMH抑制了猫的排卵和/或黄体的形成，导致黄体期的频率降低。

综上所述，本研究使用IM传递一个含有猫AMH（fcMISv2）转基因的AAV9载体，以评估其对母猫的繁殖周期、交配和繁殖力的影响。本研究结果与避孕密切相关，证明了通过AAV9-fcMISv2基因治疗可以长久抑制排卵，预防怀孕，且对治疗的母猫没有明显的不良健康影响。这些研究数据还表明，AMH可以抑制黄体期和排卵，而不影响E2水平及其对健康寿命的有益影响。因此，这种单剂量、非手术避孕方式可以作为手术绝育的可行替代方案，并为兽医实践、收容所和动物控制项目提供一个快速和易于应用的选择，以实现母猫终身避孕。

文章来源：

https://doi.org/10.1038/s41467-023-38721-0