《自然》王凌华/Humam Kadara合作团队利用单细胞和空间转录组揭示肺腺癌的细胞起源

2024年2月29日，来自美国德克萨斯大学MD安德森癌症中心的王凌华教授和Humam Kadara教授的合作团队在《自然》发表了标题为“An atlas of epithelial cell states and plasticity in lung adenocarcinoma.”的这一研究成果，在早期肺腺癌组织和癌旁区域发存在一群携带KRAS致癌基因突变的，KRT8表达阳性的肺泡中间态细胞，并证实了这种细胞最终可转化为肺腺癌细胞。

肺癌是全世界癌症死亡率最高的恶性肿瘤之一， 其中肺腺癌（Lung adenocarcinoma, LUAD）为最常见的组织学类型。虽然近年来早期检测手段的进步使得越来越多的肺腺癌患者能够得到早期诊断，但治疗手段的预后效果仍然不够理想，还亟需改善。单细胞测序技术的广泛应用助力了癌症研究，但已有的肺腺癌单细胞研究存在诸多不足，例如样本数量和样本类型有限，单细胞测序规模较小等。为找到新的治疗方法和制定早期干预策略，我们需要深入了解肺腺癌早期发生发展的细胞机制。区域癌化模型是一个能够有力解释肺腺癌起源的模型。模型认为，在多种内外因素（吸烟，紫外线，基因突变，染色体变异等）的共同作用下，即使在没有典型癌症特征的组织区域，也可能存在基因组，转录组以及表观遗传组的分子水平改变的细胞。这些区域随时间推移可能会发展成肿瘤。

鉴于此，通过对早期肺腺癌病人进行以肿瘤为中心的多点，梯度取样，综合利用单细胞测序及空间转录组等技术手段研究细胞状态和肿瘤微环境的改变，将有助于理解肺腺癌发生的生物学机制，寻找新的治疗靶点，并为肺腺癌的早期干预及新治疗方法的开发提供依据。

美国德克萨斯大学MD安德森癌症中心的王凌华教授和Humam Kadara教授的合作团队在早期肺腺癌组织和癌旁区域发现了一群携带KRAS致癌基因突变且KRT8表达阳性的肺泡中间态细胞（KRT8+ alveolar intermediate cells，KACs）。通过和Jichao Chen教授合作，该团队在基因工程小鼠模型中对肺泡上皮细胞进行了谱系标记和追踪，并证实了KACs最终可转化为肺腺癌细胞。这项突破性的研究不仅为开发针对早期肺腺癌的检测和预防策略提供了新的启示，也为推动在最早阶段检测甚至阻断肺腺癌的发展开辟了新的研究方向。

实验设计和分析工作流程的示意图概述

在这项研究中，研究人员收集了16名肺腺癌患者的63个组织样本，包含16个癌样本和47个非肿瘤样本（在距离肿瘤三个不同的空间位置梯度取样），研究组对全部样本进行了单细胞RNA测序，并对16个腺癌样本进行了全外显子组测序。这项研究工作是迄今为止关于早期未治疗的肺腺癌在上皮细胞规模和整合数据类型上最大和最全面的单细胞研究。在鉴定出正常上皮细胞和肿瘤细胞后，研究人员首先刻画了早期肺腺癌中肿瘤细胞的异质性及具有KRAS突变的肺腺癌独特的转录特征。其次，更深入地分析揭示了肿瘤细胞，尤其是带有KRAS突变的肿瘤细胞与正常上皮细胞之间的关系。结果显示一种肺泡中间态细胞在肿瘤样本中显著富集，而且该种细胞的去分化水平显著升高，提示了这群细胞与肿瘤细胞的密切关系。由于KRT8基因高表达是这种细胞的显著特征之一，研究者将其命名为KACs（KRT8+ alveolar intermediate cells）。

通过使用基因工程小鼠模型，通过对单细胞RNA测序数据的分析以及免疫荧光染色技术分析，研究者证实了小鼠模型中存在表达特征与KACs相匹配的细胞类群并将其命名为小鼠KACs。进一步分析发现小鼠KACs的出现早于KRAS突变型肿瘤的出现，提示KACs可能是一种"前体中间态细胞"。通过对肺腺癌癌病人及小鼠的单细胞RNA测序数据的拟时分析，研究者推测KACs可能来源于2型肺泡细胞。

为了验证该假设，研究者设计了能够追踪报告2型肺泡细胞来源（GFP标记）的基因工程小鼠，通过对GFP标记的细胞类群（2型肺泡细胞来源）进行单细胞测序分析，鉴定出了包括2型肺泡细胞 ，KACs细胞，1型肺泡细胞，以及肿瘤细胞的多种细胞群。研究者还利用GFP标记的2型肺泡细胞培养了类器官（organoids）并进行了多重免疫荧光染色分析， 实验结果显示烟草致癌物（Nicotine-derived nitrosamine ketone， NNK）处理组的类器官样本具有更高的KACs特征基因的表达。这些结果验证了KACs的2型肺泡细胞来源并显示了NNK暴露与KACs高度相关，揭示了KACs和肺组织损伤以及肿瘤细胞生成的密切关系。

最后，研究者使用谱系追踪（lineage tracing）技术来回答此项研究的最终问题：KACs是否能转化成肺腺癌细胞。研究者使用免疫荧光染色技术分析了来自NNK暴露（处理组）、NNK暴露后8至12周（跟进观察组）和肿瘤的样本。通过对比小鼠三组样本的免疫荧光分析结果，研究人员发现肿瘤样本中绝大多数的细胞为2型肺泡细胞来源的，经过KACs细胞状态（Krt8+Lamp3+）的细胞。此外，肿瘤样本中Krt8（KACs的标记基因之一）蛋白表达信号增强。谱系追踪模型小鼠的实验结果验证了2型肺泡细胞来源的KACs参与了肺腺癌细胞的产生。

这项大规模的多组学整合研究发现了KACs细胞在早期KRAS突变的肺腺癌中的重要作用，并使用转基因工程小鼠模型系统性地验证了KACs为来源于2型肺泡细胞的中间状态细胞，在2型肺泡细胞参与肺损伤修复，补充1型功能性肺泡细胞的生物学过程中，参与了KRAS突变型的肺腺癌细胞的产生过程。这项研究揭示了肺腺癌发生过程和上皮细胞可塑性的重要联系，为肺腺癌的预防和早期干预提供了潜在的研究靶点。

文章来源：

Guangchun Han, Ansam Sinjab, Zahraa Rahal et al,An atlas of epithelial cell states and plasticity in lung adenocarcinoma. https://www.nature.com/articles/s41586-024-07113-9/figures/1