AmyJet 倾心推荐IP专用二抗

发布者：艾美捷科技发布时间：2020-01-14

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免疫沉淀 (Immunoprecipitation，IP) 是利用抗原抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与ProteinA/G偶联的agarose或Sepharose珠子孵育，通过离心得到珠子-蛋白A/G-抗体-目的蛋白复合物，沉淀经过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5-10min，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。

在免疫沉淀实验后的WB验证环节中，当使用常规的 Anti-IgG (H+L) 酶标二抗时，通常会出现对应免疫沉淀一抗变性后产生的重链（50kDa）和轻链（25kDa）两条带。如果检测的目的蛋白分子量在此附近时，就会受到这两条带的干扰。

免疫沉淀

如何避免IP检测过程中的重、轻链干扰，AmyJet可为您提供两种方案：

方案一：选择WB一抗时，选择和IP用一抗不同的种属，避免IP一抗的干扰

IP捕获抗体类型	WB检测时一抗类型	WB检测时二抗类型	备注说明
小鼠单抗/多抗	兔多抗	HRP-标记抗兔IgG二抗	由于 IP 捕获抗体与 WB 检测一抗属于不同种属来源抗体，故WB 检测时使用 HRP-标记抗兔 IgG 二抗可以有效避免重链轻链信号的影响。
兔多抗	小鼠单抗	HRP-标记抗小鼠IgG二抗	由于IP捕获抗体与WB检测一抗属于不同种属来源抗体，故WB检测时使用HRP-标记抗小鼠IgG二抗可以有效避免重链轻链信号的影响。
兔多抗	小鼠多抗	HRP-标记抗小鼠IgG二抗

货号	名称	应用类型
AMJ-AB2003	山羊抗兔IgG二抗，HRP标记	WB，IHC，ELISA
AMJ-AB2002	山羊抗小鼠IgG二抗，HRP标记	WB，IHC，ELISA

方案二：选择只和重链或轻链反应的二抗

如果目标蛋白分子量小于30KD，为了避免抗体轻链的干扰，选择重链特异性二抗；如果目标蛋白分子量大于30KD，为了避免抗体重链的干扰，选择轻链特异性二抗。

类型	货号	名称	应用类型
无重链干扰	AMJ-AB2016	IP™ 山羊抗小鼠IgG轻链二抗，HRP标记	WB，IP
无重链干扰	AMJ-AB2017	IP™ 小鼠抗兔IgG轻链二抗，HRP标记	WB，IP
无轻链干扰	AMJ-AB2018	IP™ 山羊抗小鼠IgG重链二抗，HRP标记	WB，IP
无轻链干扰	AMJ-AB2019	IP™ 山羊抗兔IgG重链二抗，HRP标记	WB，IP

重链或轻链反应二抗

IP实验常见问题汇总：

结果	原因	解析
显影信号整体很弱，荧光信号淬灭	显影液失效	通过检查显影液清澈度初判，并通过立即更换新显影液后再曝
	底物失效	将PVDF膜重新TBST略洗几次，重新加合格的底物
	二抗孵育过多	如果操作较快，会出现第1张胶片曝光后信号极强，而第2张起可能信号淬灭；如果操作稍慢点，甚至第1张胶片起信号基本淬灭，这种情况建议重做，降低二抗浓度、减少孵育时间
条带正确，但显影过强或过弱	上样量过大	可减小上样量、提高一抗稀释度并缩短曝光时间
条带正确，但显影过强或过弱	上样量过小	可增加上样量、降低一抗稀释度并延长曝光时间
背景杂乱厚重，大片“黑区”，导致无法分析	一抗孵育时间过长或浓度过高	4℃封闭过夜，一抗孵育1 hr，并可适当增加洗膜时间
Input泳道无目的带，而IP泳道有	目的蛋白丰度不高，无法直接 Western blot 检出，而 IP 能进行浓缩富集
Input泳道有目的带，而IP泳道无	该种一抗主要识别和结合靶蛋白内部的线性表位、而非暴露在外表的的线性或空间表位，故IP制样时无法有效捕获住组织或细胞中的完整结构靶蛋白
Input泳道有目的带，而IP泳道无	该蛋白浓度极低，导致捕获过程不仅未起到富集作用，反而因为洗涤操作，使靶蛋白损失殆尽，最后几乎无靶蛋白被洗脱下来；或lysis buffer过强；或选用了不正确的beads；或一抗亚型为 IgM 或 IgA

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