TheWell Bioscience--使用无外源成分的VitroGel水凝胶基质在微型纳升液滴中生成肿瘤细胞球体

【应用】

Aquarray, Leopoldshafen, Germany

TheWell Bioscience, North Brunswick, NJ 08902

【液滴微阵列平台】

液滴微阵列（DMA）由超疏水背景上的亲水点组成，允许在平面表面上形成亚微升范围内分离且均匀的液滴。使用纳升液体分配器精确填充通常尺寸为350 - 1000 ?m的DMA斑点。每个DMA具有672 - 6048个液滴的容量，使得在DMA平台上能够进行高度微型化的高通量筛选。

图1. 具有672个1mm大小斑点的液滴微阵列，每滴分配150nL。  

DMA已被用于多种化学和生物应用，包括芯片上的高通量化学合成及随后的生物筛选（1）、基于转染的筛选（2）、斑马鱼胚胎筛选（3）、细菌筛选（4）和基于细胞的化合物筛选。细胞筛选可以使用任何细胞类型进行，例如细胞系、干细胞或原代细胞，在贴壁或悬浮培养中，使用基于球体的细胞培养模型进行2D或3D培养。使用悬滴技术在含有150个细胞的100nL液滴中，在24 - 48小时内已证明在不同的肿瘤细胞系中形成单个球体（6）。  

【VitroGel 水凝胶平台】

VitroGel无外源成分（无动物源）水凝胶系统是动物源性细胞外基质（ECM）的Z越替代品，避免了未知成分的不确定性，为获得一致的结果，提供了明确且具有生物学功能的微环境。该水凝胶在室温下具有独特的流变剪切稀化和快速恢复特性，允许高通量分配的极其顺畅的过程，并为微阵列应用提供出色的水凝胶液滴均匀性。 

本应用笔记重点介绍了使用即用型、无外源成分的功能性水凝胶系统VitroGel 水凝胶基质（VHM01）在DMA上生成肿瘤细胞球体。该水凝胶在室温下稳定，pH值中性，透明，可渗透液体/营养物质，并经过优化以支持多种细胞类型。与细胞培养基混合后，形成柔软可注射的水凝胶，非常适合本研究中的注射或液体分配。 

由于纳升体积和斑点之间的差距较小，在微型DMA平台上进行分配对液体分配器来说具有挑战性。已经确定了许多能够准确瞄准DMA上斑点的非接触式液体分配器。此外，由于水凝胶的高粘度，其分配可能具有挑战性。然而，由于其独特的流变特性，VitroGel可以在室温或37°C下保持长期（数小时）可注射状态，而不会堵塞分配器的源孔。将150nL的VitroGel -细胞混合物分配到具有672个斑点的DMA上大约需要一分钟，并产生非常均匀的模式。人宫颈癌细胞系HeLa和人黑色素瘤细胞系SK - MEL - 28在培养72小时后，在每个DMA液滴的VitroGel基质中形成许多存活的圆形球体（图2和图3）。  

图2. 通过在DMA上分配与细胞混合的VitroGel生成HeLa球体。如材料和方法中所述，72小时后进行针对波形蛋白（绿色）和KI67（红色）的免疫荧光染色。细胞核用Hoechst染色。上图：一个斑点的描述。下图：其放大图。

图3. 通过在DMA上分配与细胞混合的VitroGel生成SK - MEL 28球体。如材料和方法中所述，72小时后进行针对波形蛋白（绿色）和KI67（红色）的免疫荧光染色。细胞核用Hoechst染色。 

【结论】

总之，成功地使用即用型、无外源成分的功能性水凝胶系统VitroGel水凝胶基质（VHM01）在DMA上生成了肿瘤细胞球体。形成了两种类型的肿瘤细胞球体。通过免疫荧光染色进行了可视化。通过在DMA上分配与细胞混合的VitroGel生成HeLa球体。如材料和方法中所述，72小时后进行针对波形蛋白（绿色）和KI67（红色）的免疫荧光染色。细胞核用Hoechst染色。通过在DMA上分配与细胞混合的VitroGel生成SK - MEL 28球体。如材料和方法中所述，72小时后进行针对波形蛋白（绿色）和KI67（红色）的免疫荧光染色。细胞核用Hoechst染色。  

【材料和方法】

细胞培养

HeLa和SK - MEL 28细胞在含有10％胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。当培养物达到80 - 90％合流时进行传代。

3D培养

对于HeLa和SK - MEL 28细胞的3D培养，使用了VitroGel水凝胶基质。在含有30％FBS的DMEM培养基中制备细胞悬液。将400uL的VitroGel溶液与200uL的细胞悬液以2：1的比例（v / v）混合，以使水凝胶 - 细胞混合物的最终FBS浓度为10％。  

【分配】

使用低体积纳升分配器I - DOT Mini（AQ版）将水凝胶 - 细胞混合物分配到具有672个1mm大小斑点的液滴微阵列上。将400uL的水凝胶 - 细胞混合物加载到源孔中，并使用“VitroGel”液体类别（4滴253mbar）在66秒内进行每点150nL的分配。立即将DMA转移到含有4mL加湿缓冲液和盖子中加湿垫的培养皿中。在室温下孵育15分钟后，将50nL含有10％FCS的DMEM分配到每个液滴上。立即将DMA转移回加湿培养皿中，并在37°C和5％CO2下孵育。  

【在液滴微阵列（DMA）上进行KI67和波形蛋白的免疫荧光染色和显微镜观察】

在将细胞接种到DMA上72小时后进行染色。将DMA在适当的染色容器中浸入冰冷的PBS中洗涤三次。在染色容器中，用4％福尔马林在室温下固定细胞，然后用TBS（3X）洗涤。然后将DMA在含有0.1％Triton X - 100的TBS（9.9ml TBS + 100uL Triton X - 100）中在染色罐中孵育15分钟，然后进行三次洗涤步骤。为了减少非特异性结合，将DMA直接在DMA上与Power Block（在dd H2O中1：10稀释）一起孵育，并使用石蜡膜小心地分布在整个DMA上。用真空除去任何剩余的液体。 最后，将150nL的一抗混合物（在最大75bar下）分配到DMA的每个斑点上，并在湿润室中在4°C下孵育过夜（KI67多克隆抗体：Life Technologies目录＃PA519462，在PBS中1：50稀释；波形蛋白单克隆抗体（J144）：Invitrogen目录＃MA3 - 745，在PBS中1：50稀释）。在用TBS - Tween进行三次额外洗涤步骤后，将150nL的二抗混合物（山羊抗兔IgG，DyLightTM594：ThermoScientific＃UJ291725，1：250和山羊抗小鼠IgG（H＆L），DyLightTM 488：ThermoScientific＃UJ291725，1：250）和核标记物Hoechst（Hoechst 33343：ThermoScientific，＃62248）分配到每个斑点上，并在DMA上孵育1小时。在TBS中进行三次洗涤后，用Mowiol将细胞包埋。使用Keyence BZ - 9000显微镜（Keyence，大阪，日本），用2X和10X物镜拍摄明场和荧光显微镜图像。  

【参考文献】

M. Benz, A. Asperger, M. Hamester, A. Welle, S. Heissler, & P.A. Levkin. A combined high-throughput and high-content platform for unified on-chip synthesis, characterization and biological screening, Nature Communications, 2020, 11 (5391). 

E. Ueda, W. Feng, and P. A. Levkin. Superhydrophilic–superhydrophobic patterned surfaces as high-density cell microarrays: Optimization of reverse transfection, Healthcare Mater, 2016, 5 (2646). 

A.A. Popova, D. Marcato, R. Peravali, I.A. Wehl, U. Schepers, & P.A. Levkin. Fish-microarray: miniaturized platform for single-embryo high-throughput screenings, Advanced Functional Materials, 2018, 28 (1703486). 

W. Lei, K. Demir, J. Overhage, M. Grunze, T. Schwartz, & P.A. Levkin. Droplet-Microarray: Miniaturized platform for high-throughput screening of antimicrobial compounds, Advanced Biosystems, 2020, 4 (2000073). 

A.A. Popova, S. Dietrich, W. Huber, M. Reischl, R. Peravali, & P.A. Levkin. Miniaturized drug sensitivity and resistance test on patient-derived cells using Droplet-Microarray, SLAS TECHNOLOGY Translating Life Sciences Innovation, 2021, 26 (274).