该测定是确定药物或蛋白质对微管蛋白聚合影响的经济一步法。它是对最初由Bonne,D.等人描述的测定的改编(1)。聚合之后是荧光增强,因为随着聚合发生,荧光报告基因被掺入微管中。标准测定使用神经元微管蛋白(Cat.#T240),其产生代表微管形成的三个阶段的聚合曲线;即成核、生长和稳态平衡。其他微管蛋白,如HeLa细胞微管蛋白(货号#H001)也可用于该测定。每次检测的低体积为50μl,微管蛋白浓度低,最终浓度为2mg/ml(每次检测100μg),使其成为研究更昂贵的癌细胞微管蛋白试剂和高通量应用的理想选择。
经典的微管蛋白聚合测定使用340nm处的吸光度读数来跟踪微管的形成。它基于这样一个事实,即光被微管散射到与微管聚合物浓度成比例的程度。该检测由Cytoskeleton,Inc.(Cat.#BK006P)提供。基于荧光的测定已与基于吸光度的格式进行了比较,并在下面的表1中给出了比较。
表 1.基于荧光与基于吸光度的聚合测定的比较
检测特性 | 吸光度测定 | 荧光检测 |
每次测定使用的微管蛋白 | 300微克 | 100微克 |
反应体积 | 100 微升 | 50 微升 |
信噪比 (信噪比) | 2 | 4 |
变异系数 (cv)* | 13% | 11% |
紫杉醇EC50** | 1 微米 | 1 微米 |
长春花碱 IC50 ** | 0.6微米 | 0.6微米 |
可能出现的问题 | 标准测定形式的甘油可能会干扰药物或蛋白质结合。可以很容易地改变检测条件来测试这一点。 | 荧光报告基因可能会干扰药物或蛋白质结合。 |
作为Cytoskeleton全国总代理,艾美捷科技强烈推荐Cytoskeleton热销产品Tubulin聚合检测(荧光法-96assays 猪脑 tubulin)试剂盒。产品仅用于科研,不可用于临床诊断。
Cytoskeleton公司目前主要的产品有340余种,其产品主要覆盖肌动蛋白,微管蛋白,马达蛋白,小G蛋白,细胞外基质,活细胞成像等相关领域,提供对应的蛋白质,抗体,检测与分析试剂盒,并且产品线还在不断的扩大中。
产品名称 | 货号 | 详情 |
Tubulin聚合检测(荧光法-96assays 猪脑 tubulin)试剂盒 | BK011P | 查看 |
*:重复样品
**:在标准测定条件下。可以针对聚合增强剂或抑制剂优化条件。
试剂盒内容:该试剂盒包含足够的材料,可用于 96 μl 格式的 50 次测定。包括以下组件:
>99% 纯微管蛋白(货号 # T240)
带荧光报告基因的通用微管蛋白缓冲液
微管甘油缓冲液(货号 # BST05)
GTP 解决方案(货号 # BST06)
紫杉醇阳性对照(货号 # TXD01)
半区96孔板。黑色,平底
包含详细协议和广泛故障排除指南的手册
Tubulin聚合检测(荧光法-96assays 猪脑 tubulin)试剂盒示例结果:与微管蛋白相互作用的化合物或蛋白质通常会改变聚合的一个或多个特征相。例如,图1显示了在标准聚合反应中加入抗有丝分裂药物紫杉醇的效果。3μM浓度的紫杉醇消除了成核阶段并增强了生长阶段的Vmax。因此,该测定的一个应用是鉴定新型抗有丝分裂药物。图1还显示了添加微管不稳定药物长春花碱的效果。在3μM终浓度下,长春花碱导致Vmax急剧降低和最终聚合物质量降低。
图1.使用基于荧光的微管蛋白聚合测定法(BK011P)进行微管蛋白聚合。微管蛋白单独孵育(对照),与紫杉醇或长春花碱。每个条件都一式两份。通过360 nm激发和420 nm发射来测量聚合。微管蛋白聚合的三个相标记为对照聚合曲线;I:成核,II:生长,III:稳态平衡。
Tubulin聚合检测(荧光法-96assays 猪脑 tubulin)试剂盒文献引用:
Bonne, D., Heusele, C., Simon, C., and Pantaloni, D. (1985). 4’, 6-Diamidino-2-phenylindole, a fluorescent probe for tubulin and mictrotubules. J. Biol. Chem. 260, 2819-2825.
Cytoskeleton专注于生物化学和细胞过程研究中的纯化蛋白和便捷试剂盒开发与生产。公司提供药物筛选、信号转导、蛋白质转录后修饰(PTM)、细胞骨架研究相关的系列试剂盒和产品,尤其以细胞骨架相关研究见长,既能满足于样品较少的科学研究,也可以用于小规模筛选研究和高通量大规模筛选研究。此外,公司还提供微管蛋白,肌动蛋白,小G蛋白,GAPs,GEFs等现有产品的药物筛选服务。
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