超分辨率显微镜分析，荧光抗体该怎么选？

      1873年，德国医师Ernst Abbe 提出了“衍射极限”的概念。他预测，由于光的基本衍射性质，光学显微镜无法实现200nm以下的分辨率。实际上，当两个相隔很近的物点同时发光时，得到的图像是模糊的，无法分辨。超分辨率显微镜（SRM）的诞生打破了一个世纪多以来一直被认为无法突破的瓶颈。

      如今，科学家们已经研发了多种超分辨率技术，远远超出了衍射极限，能够观察到分子尺度的细节。SRM技术可以将细胞结构解析为亚细胞水平，从而获取有关细胞组分的3D结构的信息，并可以观察到单分子共定位。

      下面我们来简要概述了时下几种最流行的SRM技术的原理：

        1.受激发射耗竭（STED）显微镜

       STED对于有经验的荧光显微镜使用者来说相对简单，该方法和普通共聚焦显微镜（Confocal）的原理相同。普通Confocal使用单光源，而STED使用双光源。其中一个光源发射能激发荧光团——荧光标签（研究者们以此来定位和观察蛋白）的光，另一个光源发出不同波长的光，用于抑制荧光。这束光是环形的，并且与第一束光有所重叠，因此只有环形中间区域的分子会继续发出荧光。

      获得STED超分辨率图片并没有那么复杂，用户需要仔细调整参数，才能得到漂亮的结果，否则所得图片和普通confocal没有差别。

      使用传统和RESCue受激发射减损显微镜（STED）得到的细胞核膜上核孔复合体的图片。

       STED的原理：

      显微镜透镜对光的衍射会导致来自单个点的光出现在较大的区域，这称为点扩散函数（PSF）（见图1），由于PSF的存在，使得常规显微镜无法达到超分辨。

      图1：在普通光学显微镜中，成像是通过将来自点光源的光线会聚到像平面上的单个点来实现的。超出光衍射的限制，防止了射线的精确会聚，从而导致物体的图像模糊。显微镜的分辨率取决于点扩散函数（PSF）的大小，或对象在某个点的三维强度分布。在STED中，应用环形炸弹耗尽型激光器，其零点与激发激光焦点的最大值重叠。STED激光器引起荧光的“饱和耗尽”，从而“抑制了来自零点附近区域的荧光，导致有效PSF的尺寸减小”。

       而受激发射耗竭（STED）显微镜通过限制样品的荧光区域（PSF）产生超分辨率图像。STED显微镜使用两个重叠的激光，第一个按照常规显微镜激发荧光团（图2A）。第二个激光器称为耗尽激光器（STED激光器），它激发“甜甜圈”形状的激光，其中心的零强度点非常小（?30 nm）（未激发）。除了在甜甜圈的中心处之外，第二激光起到了“关闭”第一激光所产生的外圈荧光，从而将样本激发的荧光分子范围缩小到中心圆点处，这有效地降低了PSF，以产生非常小的单分子荧光聚焦区域，从而获得高分辨率图像（图2D）。

      图2：

      1.单个小于250 nm的蛋白质无法通过标准共聚焦成像解析，从而导致图像模糊

      2.STED耗尽激光器产生了淬灭外围荧光的“甜甜圈”

      3.饱和耗尽在功能上降低了激励PSF

      4.随之可以解析单个蛋白质

       适用于STED的荧光团偶联抗体：

      为了获得超分辨率，染料必须具有STED激光波长的高发射截面，并有效地实现高饱和度。这种强烈的照明确保了所有被STED激光“关闭”的分子都受受激发射的支配。合适的染料应具有低的光漂白性，具有高的量子产率和对比度，并在目标附近具有足够的标记密度。

      Jackson提供荧光染料标记的二抗，下列染料标记的二抗已被验证在STED中成功使用： AlexaFluor®488（如：115-545-003），FITC（如：715-095-150），AlexaFluor®594（如：715-585-151）和AlexaFluor®647。

        2. 随机光学重建显微镜（STORM）

      最有名的“基于探针”的技术是Betzig等人研发的光激活定位显微技术（photoactivated localization microscopy, PALM）和哈佛大学庄小威实验室发明的随机光学重建显微技术(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)。最初所有的荧光标签都是暗的。然后使用激光脉冲来激活一小部分荧光标签，随后使用另一束光来关闭这些荧光标签。不断重复这个过程，生成一系列部分荧光图，最后重建成整个视野的荧光图。，以产生分辨率优于常规方法收集的图像。

     使用超分辨率随机光学重建显微镜(stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)，科学家首次观察到了神经元轴突的细胞骨架。

     Jackson提供适用于dSTORM应用的标记二抗，简而言之，较低强度的激发光激发样品，随机激活少量染料分子。单个发荧光的染料分子足够分散，因此可以计算其点扩散函数的中心，从而推断出染料的确切位置。然后使用第二激光关闭所有分子，并重复该过程。然后，通过重叠每种染料的所有映射点扩展函数，以数学方式生成高分辨率图像。

      用于单分子定位实验的荧光团偶联抗体

     用于单分子定位的最佳染料通常非常亮，并产生足够的光子以可靠地产生紧密的高斯分布。Jackson ImmunoResearch提供了多种广谱范围内的可靠染料，例如AlexaFluor®488，AlexaFluor®647和Cy™5，可用于这些类型的实验。

     建议用于超分辨率显微镜的荧光染料偶联物：

      每种SRM技术都有各自的探针选择要求，Jackson ImmunoResearch提供多种已知在SRM应用中表现良好的荧光标记二抗。应该注意的是，SRM领域变化迅速，因此，建议从专业技术文献中寻求信息，以帮助选择合适的荧光团。

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