一步法RT-qPCR试剂盒，让你的PCR一步到位

      随着新冠病毒肆虐全球，聊病毒是个敏感话题。今天我们就从这个敏感话题着手，好好聊一聊。

       病毒是一种个体微小，结构简单，只含一种核酸（DNA或RNA）。我们现在提起来就咬牙切齿的的新冠病毒（COVID-19），就是一种RNA病毒。当然除了COVID-19，我们常听到的其他臭名昭著之辈，如艾滋病病毒、流感病毒、登革热病毒、烟草花叶病毒、噬菌体等均属于RNA病毒。这些RNA病毒让之所以让我们谈虎色变，是因为很多RNA病毒具有非常强的侵略能力，会严重影响宿主生命活动。如何精准地检测到病毒（定性）？如何有效判定出样本中的病毒含量（定量）？借助分子生物学技术可以精准检测病原体，其中的一步法RT-qPCR技术可被广泛用于RNA病毒类型判定、病毒亚型判定、病毒定量及病毒突变体等方面，广泛用于食品安全、动物疫病、疾病诊断与治疗效果评估等临床与公共卫生等领域。

      一步法RT-qPCR(One-Step reverse transcription-quantitative PCR)用于以RNA为起始模板的定性和定量分析，将RNA逆转录合成cDNA的过程与靶标基因的PCR扩增于一管内依次进行，利用荧光来监控PCR扩增产物的变化，进而判断RNA初始量的技术即为一步法RT-qPCR技术。RT-qPCR根据化学发光原理可以分为两大类：一类为染料类，包括SYBR^@Green I，通过荧光染料来指示产物的增加；一类为探针类，包括TaqMan^@探针，利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。

       染料法：

      常用的SYBR^@Green I是一种结合于小沟中的双链DNA结合染料，与双链DNA结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。SYBR^@Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。在PCR反应体系中，加入过量SYBR^@Green 荧光染料，SYBR^@Green荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR^@Green染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

      作为全球最大的克隆供应商之一，GeneCopoeia提供的BlazeTaq™ One-Step SYBR® Green RT-qPCR kit是基于SYBR Green 染料法的Real Time One-Step RT-PCR反应试剂。试剂盒以RNA为模板，逆转录反应和定量检测可在同一反应管内完成，简化操作的同时可有效降低污染的风险。试剂盒包含了性能优异的逆转录酶，以及含有热启动Taq DNA聚合酶、dNTP和必需的缓冲液成分混合而成的5×预混液。在逆转录酶作用下RNA逆转录成cDNA，并使用抗体修饰的Taq DNA聚合酶进行Real Time PCR反应，抗体的完全封闭有效避免了聚合酶在热循环反应前被激活。另外，经优化的Buffer体系大大提高了PCR反应的扩增效率和特异性，且检测灵敏度可达0.1pg总RNA，适用于各类型RNA模板的检测。

       一步法RT-qPCR染料法荧光定量试剂盒优势：

      灵敏度高：可从低至0.1pg的RNA提取物中精确检测目标RNA。

      特异性强：有效抑制引物二聚体及非特异性扩增的产生。

      扩增效率高：在宽广的GC含量范围内能维持高扩增效率。

       一步法RT-qPCR染料法荧光定量试剂盒：

      图3. 使用一步法RT-qPCR染料法荧光定量试剂盒，对HeLa细胞RNA提取物中GAPDH和Actin水平进行分析，RNA提取物以10倍梯度稀释成7个样本，总量的范围为100 ng至0.1 pg，并设无模板对照（NTC组）。 A.GAPDH的扩增曲线（红色）； B.Actin的扩增曲线（蓝色）； C.GAPDH（红色）和Actin（蓝色）扩增片段的熔解曲线。

      图2. 一步法RT-qPCR染料法荧光定量试剂盒（红色）与Competitor T试剂盒（蓝色）产品的性能比较。对HeLa细胞RNA提取物中GAPDH和Actin水平进行分析，RNA提取物以10倍梯度稀释成7个样本，总量的范围为100 ng至0.1 pg。 A.HeLa细胞提取物中GAPDH扩增曲线的比较； B.HeLa细胞提取物中Actin扩增曲线的比较。

       探针法：

      PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。再通过实时监测整个PCR进程荧光信号的积累，与标准曲线对比进行定量分析。

      作为全球最大的克隆供应商之一，GeneCopoeia提供的BlazeTaq™ Probe One-Step RT-qPCR kit是基于探针法的Real Time One-Step RT-PCR反应试剂。试剂盒以RNA为模板，逆转录反应和定量检测可在同一反应管内完成，简化操作的同时可有效降低污染的风险。试剂盒包含了性能优异的逆转录酶，以及含有热启动Taq DNA聚合酶、dNTP和必需的缓冲液成分混合而成的5×预混液。在逆转录酶作用下RNA逆转录成cDNA，并使用热启动Taq DNA聚合酶进行cDNA扩增，在DNA扩增期间，与DNA上的靶点结合的靶特异性探针被Taq DNA聚合酶的5'-3'核酸外切酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，报告基团释放并发出荧光。

      一步法RT-qPCR探针法定量试剂盒：

       图1. 一步法RT-qPCR探针法定量试剂盒（红色）与Competitor P试剂盒（蓝色）产品的性能比较。使用BlazeTaq™ Probe One-Step RT-qPCR kit，对HeLa细胞RNA提取物中ACTB(A)、GAPDH(B)和B2M(C)水平进行分析，RNA提取物以10倍梯度稀释成6个样本，总量的范围为10 ng至0.1 pg。

      图2. 使用BlazeTaq™ Probe One-Step RT-qPCR kit，对HeLa细胞RNA提取物中ACTB(A)、GAPDH(B)和B2M(C)水平进行单通道和三通道分析，RNA提取物以10倍梯度稀释成7个样本，总量的范围为100 ng至0.1 pg，结果显示，单通道和三通道的扩增效率相同。

      艾美捷科技有限公司，通过提供完整的产品和服务体系、便利的客户关系和供应链管理，为生命科学研究工作者提供整体打包方案。我们的企业的核心价值观：“激情、敬业、学习、创新、合作、卓越”。作为一家具有尖端的技术实力、一流的经营管理水平和完善的市场销售体系的生物高科技企业，总部位于武汉光谷国家级高新技术开发区，服务面向全国。艾美捷科技是集进口试剂、实验室耗材销售、技术服务与合约开发为一体的专业化高科技公司，为用户提供最前沿的专业资讯、完备的产品、整合的解决方案，及优质的物流服务。为了更好的服务客户，公司组建了一支经验丰富的研发团队-艾美捷生物技术中心，进入研发生产阶段，将更优质的产品推荐给国内生物领域的同仁们!

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