PCR疑难问题粉碎机（三）——逆转录PCR

     【前情回顾】PCR疑难问题粉碎机（一）——终点PCR

     【前情回顾】PCR疑难问题粉碎机（二）——荧光定量PCR

       逆转录 PCR（Reverse TranscriptionPCR, RT-PCR）是一种以 RNA 为样本，RNA链被逆转录成为互补 DNA（cDNA），再以此为模板通过 PCR 进行 DNA 扩增。在实际应用中，RT-PCR 分为一步法 RT-PCR 和两步法 RT-PCR。整个反转录实验过程有三个重要的因素，分别是RNA模板、反转录时所使用的引物类型、反转录酶 。

       RNA模板

      高质量的 RNA 基本有几个参数可供参考，首先是 OD260/280 以及 OD260/230的值应该都是 2.0 左右，如果 OD260/280 小于 1.9，说明 RNA 中有一些蛋白质的残留，如果这个值大于 2.1，则很可能样本中 RNA 有一定的降解。OD260/230如果小于 2.0，说明 RNA 中含有异硫氰酸胍，酚残留，而这些物质对逆转录反应影响是非常大的。另外就是琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整性，正常的 RNA一般呈现三条带，即 5s、18s、28s，其各自的亮度呈现递增状态，依据物种不同可逆转录 PCR能存在些许差异。当 RNA 出现降解时，反馈最明显的是 5s rRNA 的亮度显著提高。下图展示的分别是高质量 RNA、稍有降解以及完全降解的实例：

       反转录引物

      提取到了高质量的 RNA模板后，下一个需要考虑的问题便是引物的选择了。通常，反转录引物有三类，分别是 oligodT、随机引物和序列特异性引物：oligodT引物能特异性结合在含有 polyA 尾的 mRNA 末端起始反转录反应，但这一特性决定了它只能扩增含有 polyA 尾的 mRNA，而且对 RNA 模板的质量要求较高，一旦 polyA 尾发生降解，就不能被引物所识别，从而导致产物中没有相应基因的cDNA；随机引物一般含有 6-9 个随机序列的碱基，能够随机识别结合在 RNA 模板上，因此这类引物的优点在于能同所有类型的 RNA 结合，而且比较适合于含有二级结构的 RNA 及微量样本，具有较高的反转录灵敏度。

      但缺点在于，结合的随机性会造成 cDNA小片段较多，有时候还会对微量目的片段造成稀释；序列特异性引物，顾名思义，针对于特定的序列设计的反转录引物，用于特异性的反转录某一段序列。在实际的应用中，我们通常会研究同一个个体或细胞中不同基因表达水平的变化，因此序列特异性基因相对用的少一些。Solis BioDyn 可供的反转录预混液中可提供多种不同的引物（oligodT、随机引物、以及 oligodT 与随机引物的结合）供您选择，满足您的一切实验需求！

       逆转录酶

      Solis BioDyn 可提供两种逆转录酶：分别是 MMLV（RNase H+）和 SOLIScript（RNase H-）逆转录酶。RNase H，是一种核糖核酸内切酶，可以特异性地水解DNA-RNA 杂合链中的 RNA，不能水解单链或双链 DNA 或 RNA。

     艾美捷科技有限公司，通过提供完整的产品和服务体系、便利的客户关系和供应链管理，为生命科学研究工作者提供整体打包方案。我们的企业的核心价值观：“激情、敬业、学习、创新、合作、卓越”。激发我们内在的创造力，提供有竞争力的生物医学产品和服务，持续为客户创造最大价值是我们的企业使命。我们的企业愿景是成为受人尊重、世界一流的生物医学产品及服务供应商。

      作为一家具有尖端的技术实力、一流的经营管理水平和完善的市场销售体系的生物高科技企业，总部位于武汉光谷国家级高新技术开发区，服务面向全国。艾美捷科技是集进口试剂、实验室耗材销售、技术服务与合约开发为一体的专业化高科技公司，为用户提供最前沿的专业资讯、完备的产品、整合的解决方案，及优质的物流服务。为了更好的服务客户，公司组建了一支经验丰富的研发团队-艾美捷生物技术中心，进入研发生产阶段，将更优质的产品推荐给国内生物领域的同仁们!

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                  三点：

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