【复盘】m6A甲基化疑难杂症&治疗方法

表观遗传相关的研究近年来也是一大研究热点，我们知道的表观遗传修饰有组蛋白修饰，DNA甲基化，RNA甲基化等等。之前的推文也有专门介绍RNA甲基化相关的研究现状和优势RNA m6A甲基化综述，以及相关的产品推荐：详情。我们力荐的m6A检测试剂盒p-9005也因其独特的优势和性能被广大研究者偏爱，也是如今热卖的产品，而今天小编就给大家复盘一下关于p-9005 检测m6A甲基化相关的疑难杂症和治疗方法。

一、 RNA甲基相关概念

RNA甲基化是RNA的可逆翻译后修饰，其表观遗传地影响许多生物过程。它发生在不同的RNA中，包括tRNA，rRNA，mRNA，tmRNA，snRNA，snoRNA，miRNA和病毒RNA。不同的RNA-甲基转移酶具备相应的催化策略，用于RNA甲基化。

6-甲基腺嘌呤（m6A）是在存在于真核生物的RNA分子中最常见的和丰富的甲基化修饰和占所有RNA甲基化的80％以上。它可以被称为“第五RNA碱基”并且在调节胚胎发育和细胞命运中具有广泛的作用。

而我们推荐的p-9005产品是Epigentek公司的力荐产品，Epigentek集团公司是全球领先的创新技术和表观遗传学相关研究产品的开发商和供应商，专门做表观遗传方面产品，可以说在表观遗传方面，他们是专家。

二、 p-9005产品性能和优势

性能：EpiQuik™m6A RNA甲基化定量试剂盒（比色）是一整套优化的缓冲液和试剂，用于比色定量RNA中的N6-甲基腺苷（m6A或6mA）。它适用于使用从任何物种（例如哺乳动物，植物，真菌，细菌和病毒）中分离的总RNA直接检测m6A RNA甲基化状态。

EpiQuik™m6A RNA甲基化定量试剂盒优势：

      1. 检测物种多样化，无物种限制；

      2.操作简便快速，3~4h即可完成整个实验

      3.高灵敏度，其检测极限可低至10 pg m6A

      4.独特的结合溶液—可从mRNA和ncRNA（例如tRNA，rRNA和snRNA）中定量m6A

      5.高特异性

      6.带孔微孔板格式使该测定灵活用于手动或高通量分析。

      7.简单，可靠且一致的测定条件

三、p-9005检测的疑难杂症和药方

1.病症一：样本

      对于这个试剂盒，很多人对与样本方面有很多的疑问，虽然试剂说明书上说可适用任何物种的m6A检测，但是同学们还是有各种各样的问题：

（1）RNA样本类型

      处方：培养的细胞，新鲜和冷冻的组织，石蜡包埋的组织，血液，体验等等样本的总RNA，mRNA，tRNA，rRNA和snRNA均可适用该试剂盒。

（2）RNA样本提取方式

      处方：市面上销售的试剂盒提取的均可，Trizol法可能是可以的，但是Trizol法提取的请确保提取后将RNA重新溶解在不含RNase的水中或合适的缓冲液（例如TE）中，并且RNA质量高且相对不含DNA。

（3）RNA样本符合要求的标准

      处方：OD 260/280 >1.9。260/230 > 1.7 【无DNA污染】

2.病症二: 对照

      关于试剂盒中的对照方面，也是有很多同学问询。

（1）阳性对照怎么设置

      对于第一次上手做这个实验的同学们或许都会有些疑惑，阳性对照难道不都是要做标准曲线的吗？不然怎么对照和计算呢？

      处方：其实，这个试剂盒是可以根据实验需要进行选择做单点对照（0.5ng/ml）还是做标准曲线（0.02~1ng/ml）。建议做复孔哟。

（2）阳性对照信号太弱

      处方：【1】添加至孔中的PC量不足，确保加入足够量的PC；【2】标准液未进行最佳稀释，并充分混合；【3】确保PC的保存方式是按照说明书进行保存的，一定要保存在指定条件下哟，【4】在使用的时候，要注意稀释后放置在冰上，保证有效成分不被讲解。

（3）阴性对照背景值太高

处方：【1】可能没有洗干净，按照说明书进行清洗；【2】被PC或者样本污染了，切记要换枪头加样；【3】孵育时间太长，按照说明书进行操作1~10min，最长也不能超过2h；【4】显色时间过长，可适当缩减显色时间。

（4）样本值太低或者没信号

处方：

     【1】可能是因为没有加入足够量的RNA。厂家推荐的样本输入量为100ng~300ng，200ng为最佳，但是这又不是绝对的噢，同学们可根据自己的样本做相应的调整尤其在信号偏弱的情况下，可适当上调RNA的输入量。

     【2】可能是因为产品本身m6A的含量就很低。

     【3】可能是样本的纯度不够，有DNA或者其他的污染，或者RNA发生了降解，这些都可能造成低信号。

     【4】mRNA样本的话，可能因为片段太小（<80 nts）,也会导致低信号。

3.病症三：数据分析

（1）如何计算标曲

      处方：线性回归，二阶多项式，四参数对数回归都可以。

（2）不同输入量检测出来的数据是否可一同进行数据分析?

       处方：是可以的，但是要注意计算的时候要以不同的数据进行。比如你第一次的样本输入量是200ng，计算公式带入的值为200；第二次样本输入量是300ng，计算公式带入的值必须为300.

（3）什么情况下的样本OD值被认为是可用的？

       处方：只要样品的OD高于NC的数值，该数据仍可用于计算m6A水平。

（4）重复孔之间差异较大怎么计算？

      处方：对于重复孔之间差异较大，我们若是重复孔3个以上的话，我们一般会选择舍弃其中差异特别特别大的一个值后再进行计算，但是只有2个孔的话，该怎么办呢？这个时候我们不能随便舍弃任何一个孔的值，同样也没有办法提供相关的建议。但是需要注意：p-9005比色测定的%CV约为15%。

4.病症四：稀释

（1）需要稀释的试剂组分如何稀释？

      处方：按照说明书上给的配制比例进行稀释，用TE buffer稀释，建议即用即配，计算好所需的量再进行稀释配制。

（2）为什么有些组分稀释后需要放置在冰上？

处方：使用前应将稀释的成分（例如PC标准品）放在冰上，以最大程度地减少试剂降解并保持试剂完整性。

（3）稀释液必须是TE吗？可以替换成DEPC水或者无RNAase的水吗？

处方：可以使用DEPC水替代TE buffer，无RNAase的水也可以。

5.其他

（1）所有组分需要放置在室温条件下回温吗？

处方：对于产品组份中的Wash buffer，保存在低温下可能会有盐离子等沉淀，在使用前需要将其拿至室温进行回温，沉淀即可溶解，这样可进行正常的实验。

（2）如何减少复孔间差异？

处方：

【1】在板中垂直而不是水平地加载复制样品，因为这可以确保同时添加溶液以复制孔，并有助于最小化复制差异。

【2】确保从孔中完全去除洗涤缓冲液，因为任何残留的缓冲液都会增加背景信号和重复变异性，尤其是在敏感的ELISA中（例如用于甲基化检测的ELISA）。

【3】使用手动移液器代替典型的板轻拂/倾倒方法，以确保完全去除缓冲液并最大程度减少孔间污染。

（3）有相关的参考文献吗？

说道参考文献，不仅有，而且非常多，还是处于实时更新的状态，日期都非常的新（https://www.epigentek.com/catalog/epiquik-m6a-rna-methylation-quantification-kit-colorimetric-p-3646.html）：

Tsuruta K. et. al. et. al. (September 2020). RNA N6-methyladenosine demethylase FTO regulates PD-L1 expression in colon cancer cellsBiochemical and Biophysical Research Communications. 530(1)

Chen S et. al. (August 2020). WTAP promotes osteosarcoma tumorigenesis by repressing HMBOX1 expression in an m⁶A-dependent manner.Cell Death Dis. 11(8):659.

Xu Y et. al. (August 2020). The FTO/miR-181b-3p/ARL5B signaling pathway regulates cell migration and invasion in breast cancer.Cancer Commun (Lond).

Du J. et. al. et. al. (August 2020). N 6-Adenosine Methylation of Socs1 mRNA is Required to Sustain the Negative Feedback Control of Macrophage ActivationDevelopmental Cell.

Zhang S et. al. (August 2020). Pregnancy carbon black nanoparticles exposure-induced neurobehavioral deficits are associated with m6A modification in offspring.

Yang Z. et. al. et. al. (August 2020). RNA N6-Methyladenosine Reader IGF2BP3 Regulates Cell Cycle and Angiogenesis in Colon CancerGeneral Surgery.

Zhu S et. al. (July 2020). Dexmedetomidine Suppressed the Biological Behavior of HK-2 Cells Treated with LPS by Down-Regulating ALKBH5.

Jian D et. al. (July 2020). METTL14 aggravates endothelial inflammation and atherosclerosis by increasing FOXO1 N6-methyladeosine modifications.10(20):8939-8956.

最后，温馨提示：这个产品p-9005是有配套的中文说明书的，但是还请各位同学们拿到产品后，认真阅读英文说明书喔，英文说明书为主，中文说明书为辅。

以上就是小编整理的同学们常问的有关这个试剂盒的问题，各位同学若是有以上问题，可以借鉴哟~~

作为一家具有高端的技术实力、先进的经营管理水平和完善的市场销售体系的生物高科技企业，总部位于武汉光谷高新技术开发区，服务面向全国。艾美捷科技是集进口试剂、实验室耗材销售、技术服务与合约开发为一体的专业化高科技公司，为用户提供专业的前沿资讯、完备的产品、整合的解决方案，及优质的物流服务。为了更好的服务客户，公司组建了一支经验丰富的研发团队-艾美捷生物技术中心，进入研发生产阶段，将更优质的产品推荐给国内生物领域的同仁们!

 艾美捷科技与国内外优秀的生物试剂供应商优保持着密切的合作关系，目前已成为众多国际知名品牌的中国总代理或一级代理，主要包括：AmyJet、AAT Bioquest、Abnova、Agrisera、Biovision、Biosensis、Cayman Chemical、Caisson Labs、Cytoskeleton、CytoNiChe、Epigentek、Equitech-Bio、Hycult Biotech、Jackson、LifeSensors、LigaTrap、ProSpec、Norgen Biotek、Mabtech、Matreya、iRegene、StressMarq、ImmunoReagents、SouthernBiotech、Origene、US Biological、Solis BioDyne等，可以在短时间内为用户提供专业的前沿资讯、完备的产品及物流服务。