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Cube Biotech-文献解读-纳米盘SMALP制备巨型单层囊泡(Giant Unilamellar Vesicles, GUVs)的新策略

发布者:艾美捷科技    发布时间:2024-08-20     
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细胞膜蛋白在细胞生物学和药物发现中起着至关重要的作用。这些蛋白涉及多种生理功能,如运输、信号传导、细胞内通讯和催化。由于它们在基本细胞过程中的核心角色,细胞膜蛋白成为有吸引力的药物靶点,60%的FDA批准的药物靶标都是细胞膜蛋白。然而,研究这些蛋白质在复杂的细胞膜环境中的功能仍然是一个挑战。为了更准确地模拟细胞环境,研究人员开发了多种实验系统,包括巨型单层囊泡(GUVs)。GUVs由于其细胞大小的尺寸和内部水相与外部环境的分离,为研究细胞膜蛋白提供了接近细胞的条件。

然而,传统上制备GUVs的方法,如电形成法和融合预成GUVs的方法,往往需要使用去污剂,这可能对脆弱的蛋白质造成损害。为了克服这一挑战,研究人员探索了利用苯乙烯马来酸共聚物(SMA)形成的脂质纳米盘(SMALPs)来制备GUVs的新策略。SMALPs能够在不使用去污剂的情况下稳定脂质双层,从而保留膜蛋白的天然脂质环境。

SMALP.png

 

《Lipid vesicle formation by encapsulation of SMALPs in surfactant-stabilised droplets》开发了一种创新方法,通过表面活性剂稳定液滴作为模板,将SMALPs封装在其中,进而形成GUVs。这种方法避免了使用去污剂,有望减少对膜蛋白的损害。

SMALPs.png

 

此示意图展示了从苯乙烯马来酸脂质纳米盘(Styrene Maleic Acid Lipid Particles, SMALPs)形成脂质囊泡(Vesicles)的整体过程。


研究方法

在本研究中,研究者开发了一种利用表面活性剂稳定液滴作为模板,从SMALPs制备GUVs的新方法。为了追踪SMALPs与液滴界面上的表面活性剂之间的相互作用,作者们合成了一种新型荧光SMA变体(FSMA),将荧光素与SMA偶联。以下是实验方法的主要步骤:


FSMA的合成与表征

将SMA与荧光素偶联,制备FSMA。

使用FTIR对FSMA进行表征,确认荧光素的成功偶联。

比较FSMA与SMA在形成纳米盘时的效率,发现FSMA在较低浓度下与SMA表现相似,但在较高浓度下效率下降。


Krytox与FSMA/SMA的相互作用:

通过将FSMA/SMA溶液置于含有Krytox表面活性剂的油相上,评估其相互作用。发现Krytox浓度增加时,FSMA/SMA在油相中的存在量增加,表明Krytox与FSMA/SMA之间存在直接相互作用。

通过荧光显微镜观察FSMA和FSMALPs在含有不同表面活性剂混合物液滴中的分布,进一步确认Krytox诱导FSMA在液滴界面上的积累。


GUV的形成与释放:

使用不同脂质组合、pH值、SMA浓度和表面活性剂混合物的SMALPs制备液滴。

通过添加脱乳剂(如PFO)释放GUVs,并使用荧光显微镜评估释放效率。

发现中性SMALPs在所有条件下均能形成GUVs,但释放效率受SMA浓度、Krytox浓度和pH值影响显著。


GUV的结构与完整性评估:

使用负染色透射电子显微镜(TEM)和冷冻透射电子显微镜(cryo-TEM)观察GUVs的形态和双层结构。

发现通过SMALPs形成的GUVs与电形成法得到的GUVs形态相似,但双层结构较为粗糙,存在孔隙。

使用荧光素渗漏实验评估GUVs的完整性,发现小分子荧光素能迅速渗漏进入GUVs内部,但大分子荧光素-葡聚糖渗漏较慢。

 

减少GUV渗漏的策略:

尝试通过透析、离心浓缩器和polyhunter beads去除游离SMA,但未能显著改善GUV的渗漏问题。

通过添加CaCl2或HCl使SMA聚合,虽然导致部分GUVs减少渗漏,但效果短暂。

将SMALPs与大型单层囊泡(LUVs)共挤出,再经离心洗涤去除游离SMA,形成最终GUVs,有效减少渗漏。

 

在本文中,研究者使用了三种不同的方法来去除SMALPs溶液中的游离SMA,以减少GUV的渗漏问题。其中,使用Cube Biotech生产的polyhunter beads(cat#19103)作为一种去除游离聚合物的策略,被证明是尝试性的一种手段,但并未显著改善GUV的渗漏情况。尽管如此,polyhunter beads在以下几个方面展示了其潜在的价值:

高效去除游离聚合物: Polyhunter beads专为去除溶液中的游离聚合物而设计,具有高效的吸附能力。在本文的实验中,尽管未能完全解决GUV渗漏问题,但该方法为去除SMA提供了一种有效尝试,为进一步优化实验条件提供了思路。

简化实验操作: 相比透析和离心浓缩器等方法,polyhunter beads的使用更为简便快捷。它不需要复杂的设备支持,只需简单的柱层析操作即可实现游离聚合物的去除,有助于提高实验效率。

适用于多种应用场景: Polyhunter beads不仅限于本文所描述的去除SMA的应用,还可广泛应用于生物制剂纯化、药物研发等领域,特别是在需要高效去除溶液中游离成分的场景中展现出其独特优势。

促进科学研究与工业应用: 随着生物技术和制药工业的发展,对高效、稳定的生物制剂和药物递送系统的需求日益增加。Polyhunter beads作为一种先进的纯化工具,有助于促进相关领域的科学研究与工业应用,推动技术创新与发展。

备注:琼脂糖珠,Cube Biotech还可以提供PolyHunter MagBeads磁珠

 

本文成功展示了利用SMALPs在表面活性剂稳定液滴中组装形成GUVs的可行性,并探讨了影响GUV形成和释放效率的多种因素。尽管通过FSMA的荧光特性揭示了GUV双层结构的粗糙性和孔隙问题,但通过多种策略尝试减少渗漏问题表明,直接从SMALPs形成稳定、完整的GUVs仍面临挑战。Polyhunter beads作为去除游离SMA的一种尝试性手段,展示了其在生物制剂纯化中的潜力,为进一步优化实验条件提供了新的思路。未来研究可探索更多有效的聚合物去除策略或新型纳米盘形成材料,以实现更高效的GUV制备与应用。

 



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