【文献解读】BPS Bioscience，PARPtrap 试剂盒，助力新型强效PARP抑制剂的研发

PARP是一种在DNA修复、转录、凋亡和免疫功能中发挥关键作用的酶。PARP-1招募合成DNA酶来激活DNA修复。PARP-2维持基因组稳定性并修复DNA单链断裂(SSB。PARP-1和PARP-2在DNA修复系统中具有相同的调节机制，但它们与DNA断裂结合的机制不同。PARP抑制剂与PARP酶结合后，PARP蛋白会与DNA损伤位点结合形成PARP-DNA复合物而无法分离，这就造成了其他DNA修复蛋白无法参与修复过程，甚至会造成进一步形成DNA的双链损伤，这就是制剂所造成的PARP Trap效应。由于PARP Trap对肿瘤细胞的具有更强的杀伤效应，因此，对抑制剂的PARP Trap能力检测变的非常重要。  

迄今为止，四种PARP抑制剂(olaparib、rucaparib、niraparib和talazoparib)已获得FDA批准用于各种适应症，如卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌患者。PARP抑制剂对PARP家族成员和PARP-DNA捕获效力表现出不同的抑制作用。这些特性与独特的安全性/有效性特征相关。 

近期，国际团队在Molecular Cancer Therapeutics（AACR）在线发表了题为"Venadaparib Is a Novel and Selective PARP Inhibitor with Improved Physicochemical Properties, Efficacy, and Safety"的文章，合成了新型强效PARP抑制剂维那达帕利(Venadaparib，也称为IDX-1197或NOV140101)，评估了Venadaparib对PARP酶、PAR形成和PARP捕获活性的疗效，以及对BRCA突变细胞株的生长抑制作用，还建立了体外和体内模型，以研究药代动力学/药效学、疗效和毒性。Venadaparib将有望成为下一代PARP抑制剂。Venadaparib的疗效和安全性的Ib/IIa期研究已经启动。  

艾美捷科技作为BPS Bioscience中国区代理，非常荣幸能够作为供应商为该项研究提供高品质PARPtrap Assay Kit for PARP1（80584），为生物医学领域的科研探索贡献一份力量。  

BPS Bioscience特别的PARPtrap检测试剂盒，非常适用于药物研发和高通量筛选应用中，筛选增强PARP/DNA固定能力的小分子化合物。

* 以上产品，均为荧光偏振测定法（fluorescence polarization, FP）

引用产品：

该项研究中使用了艾美捷科技代理的BPS Bioscience的PARPtrap Assay Kit for PARP1（80584），用于检测PARP1捕获检测。  

【实验技术，延伸解读】

① PARP trapping assay，PARP捕获检测试验

Venadaparib对重组人PARP-1酶的DNA结合活性的影响是通过BPS Bioscience进行的体外酶活性测定来确定的。PARPtrap酶活性测定试剂盒（目录号80584；BPS Bioscience）用于该测定。Venadaparib、olaparib、rucaparib、niraparib、talazoparib和veliparib在浓度范围为0.000026至5μmol/L进行了检测。根据制造商的说明进行酶反应后，使用激发波长为485nm和发射波长为528nm的M1000微孔板阅读器（Tecan Infinite）测量了荧光信号。 

② Enzymatic assay against recombinant PARP enzymes，重组PARP酶的酶学检测

venadaparib对重组人PARP酶（PARP-1、PARP-2、PARP-3、TNKS-1、TNKS-2、PARP-6、PARP-7、PARP-8、PARP-10、PARP-11、PARP-12、PARP-14和PARP-15，均采购自BPS Bioscience）进行了体外酶活性分析。Venadaparib在浓度范围为0.000005至10μmol/L进行检测。采用Synergy 2微孔板读数仪（BioTek Instruments）测量了发光输出。使用Prism 9（GraphPad Software）确定了IC50。 

【产品解读】

PARPtrap Assay Kit for PARP1（80584）

PARPtrap Assay Kit for PARP1旨在利用荧光偏振（FP）高通量筛选测定法测量PARP1/DNA复合物形成。PARP1以其DNA结合结构域而闻名。与DNA的结合激活PARP1，在NAD+存在的情况下，PARP1会对自身进行核糖基化（自动核糖基化），这导致核糖聚合物的负电荷积累，从而导致PARP1从DNA上解离。然而，在一些抑制剂的存在下，PARP仍然与DNA结合，这种现象称为困扰。已经证明，被困的PARP-DNA复合物对癌细胞具有高度毒性，因此这类抑制剂对癌症治疗可能是可取的。  

PARPtrap Assay Kit for PARP1的关键是荧光标记的寡核苷酸双链。在未发生核糖基化的情况下，PARP1与荧光探针结合，形成大的复合物，并导致高度偏振光的发射。然而，在自动核糖基化后，PARP1从寡核苷酸双链解离，然后自由旋转，发射较少偏振光。添加PARP1抑制剂会导致PARP1被困在荧光寡核苷酸双链中，并以剂量依赖的方式增加FP信号。 

PARPtrap Assay Kit for PARP1是一种荧光偏振均相分析法。FP信号是使用能够测量荧光偏振的荧光微孔板读数器来测量的。   

产品组分：（96次规格，为例）

实验步骤（简易汉化，请务必以英文原版说明书为准）：

• 所有样本和对照应进行重复操作。

• 实验应包括一个“空白”、一个“参考”，一个“低FP对照”和一个“高FP对照”。

1. 准备Master Mix（每孔20 ul）：N孔 x（6 μl 5倍PARPtrap测定缓冲液 + 1 ul 25 nM荧光标记的DNA + 13 μl蒸馏水）。例如，对于20个孔，准备：120 μl 5倍PARPtrap测定缓冲液 + 20 ul 25 nM荧光标记的DNA + 260 μl蒸馏水。

2. 通过将1份5倍PARPtrapTM测定缓冲液稀释为4份蒸馏水，制备1倍PARPtrapTM测定缓冲液。只稀释所需的试剂量。

3. 准备抑制剂溶液。

   如果抑制剂化合物溶解在DMSO中，将其在水中稀释10倍，使得所有样本中DMSO的最终浓度为1%。如果化合物溶解在除DMSO以外的稀释剂中，请使用该稀释剂制备对照稀释剂溶液。

4. 准备酶： 在冰上解冻PARP1酶。简短离心含有酶的管子，使其完全恢复管子中的全部内容。用1倍PARPtrap测定缓冲液稀释酶至约0.5 ng/ul。

   注意：PARP1酶对冻结/解冻很敏感。避免多次冻结/解冻。虽然我们不建议这样做，但如果不一次使用所有试剂孔，请计算所需的PARP1量，只稀释足够实验所需的量，并将剩余的未稀释PARP1酶分装并储存在-80°C。不要再次使用解冻的分装液或稀释的酶。

5. 按照下表向“高FP对照”，“低FP对照”，“测试抑制剂”和“参考”孔中加入反应的每个组分：

6. 向标记为“空白”的孔中加入12 ul 5倍PARPtrap测定缓冲液 + 28 ul蒸馏水 + 5 ul稀释剂（例如DMSO 10%）。

   注意，“空白”包含反应的缓冲成分，但不包含荧光探针或PARP1酶。

   备注：

• 参考：一个缺乏PARP1的阴性对照，其中所有荧光DNA以自由形式存在，FP最低（与空白不同，空白中没有荧光探针）。参考用于进行计算。

• 高FP对照：不添加NAD+的条件，因此所有与荧光DNA结合的PARP1不能发生核糖基化反应，仍与DNA结合，导致FP达到试剂盒允许的最大值。

• 低FP对照：在存在NAD+的情况下，所有与荧光DNA结合的PARP1都被允许发生核糖基化反应并与DNA解离，导致主要为自由DNA和低FP。这是在没有抑制剂的情况下对应于最大PARP1核糖基化活性的条件。

• 测试抑制剂：FP将与抑制活性水平和结果陷阱在荧光核苷酸双链上成正比增加。

• 稀释剂溶液：与用于制备测试抑制剂的DMSO浓度相同，但不含抑制剂。

7. 室温孵育30-60分钟。

8. 向标记为“高FP对照”的孔中加入5 ul蒸馏水。

9. 向“空白”、“低FP对照”、“测试抑制剂”和“参考”孔中加入5 ul 10倍NAD+，启动PARP1酶反应。不要向“高FP对照”中加入NAD+。 这将使最终反应体积达到50 ?l。 室温孵育板子60分钟。

10. 使用能够在470-480 nm波长范围内激发和在508-528 nm范围内检测发射光的微孔板读数器读取样品的荧光极化值。

    从所有值中减去空白值。

References

1. Murai, J., et al. Molecular Cancer Therapeutics 2014. 13:433-443.

2. Murai, J., et. al. Cancer Research 2012. 72:5588-5599.

3. Zandarashvili, L., et al. Science 2020. 368(6486): eaax6367.

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BPS Bioscience，激酶研究专家，活性酶、激酶活性/抑制剂筛选检测试剂盒、慢病毒等，产品涉及临床前药物开发过程的每个阶段，包括磷酸酶、组蛋白去甲基化酶、组蛋白甲基化转移酶、HDACs、聚ADP核糖聚合酶（PARP）等热门指标的蛋白酶及酶活/抑制剂筛选检测试剂盒。详情清咨询艾美捷科技：https://www.amyjet.com/