m6A RNA甲基化定量试剂盒（P-9005）中文说明书及常见问题解答

在之前的文章中，我们复盘了m6A甲基化疑难杂症&治疗方法

N6-甲基腺嘌呤(m6A）是真核生物最常见和最丰富的RNA分子修饰，占所有 RNA 甲基化的 80% 以上。随着RNA甲基化研究越来越热，科学研究界刮起了一阵m6A RNA甲基化研究的飓风。站在风口的研究学者们，都选择了Epigentek品牌的P-9005产品EpiQuik M6A RNA Methylation Quantification Kit（M6A RNA甲基化定量检测试剂盒）。

试剂盒原理

P-9005使用独家配方试剂使RNA被高效的结合吸附在微孔板上。使用特异性捕获 N6-甲基腺苷抗体和检测抗体检测 N6-甲基腺苷 (m6A)。检测到的信号得到增强，然后通过读取微孔板分光光度计中 450 nm 波长的吸光度进行比色定量。m6A 的量与测得的 OD 强度成正比。

P-9005-中文说明书链接

常见问题解答

在使用P-9005试剂盒的过程中，客户往往会提出各种问题，小艾这里整理了一下常见的四大类FAQ。

一、实验样品类

1.试剂盒样品有没有种属限制？

解答：P-9005试剂盒没有种属限制，但是需要是提取好的RNA样品。

2.RNA样品纯度要求和输入量？

解答：RNA纯度要求：A260/280>1.9；A260/230>1.7。无DNA污染；另外RNA序列长度大于80nts，以便RNA可以较好的结合在板上。

RNA输入量：对于每次实验RNA的输入量是100-300ng。最为理想的RNA的输入量应该是200ng，正如我们所知m6A通常不到总RNA的0.1%。

二、试剂盒类

1.有效期是多久？

解答：客户收到货后，有效期6个月。

2.P-9005试剂盒里的组分是否可以单独购买吗?

解答：可以单独购买，但是建议客户购买完整试剂盒。

3.在Date Sheet中，它没有告诉我们应该使用什么样的材料来避免RNase，RNase是否会影响这个试剂盒的结果？

解答：实验中涉及到的试剂都是不含RNase的，而且当RNA结合在板上后，RNase将不会再影响实验结果。

4.客户的缓冲液是50mM的PH8的tris-盐酸缓冲液，可以用这个缓冲液分装吗？

解答：尽量推荐使用与厂家相同配方的溶液进行分装。其他溶度的缓冲液是否可用，需要客户自行尝试。

三、产品说明书类

1.试剂盒孔板数指的是可以检测的样品数量吗？

解答：48/96孔试剂盒只能做48/96个test，而不是48/96个样品。相应的试剂会比48孔稍微多一点，因为要考虑到加样损耗的因素。

2.加样时RNA样品体积多少合适？

解答：在与RNA的结合过程中，建议的200ngRNA的样本量体积在1-8uL，这样才能保证最佳的结合效率。

3.抗体稀释比例是多少？

解答：CA和DA的原始浓度都是1000X，但是稀释倍数不同，CA按照1：1000稀释，DA按照1：2000稀释，加大DA的稀释比例降低背景信号。

4.P-9005做m6A甲基化的话，为什么要用带滤芯的枪头？还有在第4步，m6A RNA捕获时，洗涤的操作溶液是直接用枪头吸掉呢，还是可以直接倒掉？

解答：这里使用带滤芯枪头，目的是最大限度避免移液器带来的交叉污染。如果客户操作无误，用普通枪头也是可以的；使用手动移液器代替典型的板轻拂/倾倒方法，以确保完全去除缓冲液并最大程度减少孔间污染。注意，将移液枪沿孔的一侧慢慢向底部引导，避免刮擦到孔底表面。

5.加入80ul的结合液后，再加入RNA，孵育90min后，将BS移除，这时候RNA在哪？

解答：RNA被高效RNA结合液结合在孔板底表面。八联管孔底表面有预涂处理，带正电，RNA的磷酸骨架带负电，在BS结合液（Binding Solution）的作用下，带负电的RNA可以稳定的结合在板上。

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