热点课题研究—慢病毒载体

      在我们的课题研究中，很多小伙伴们应该都涉及到基因功能的研究。在基因功能研究过程中，我们少不了要去给这个基因进行过表达、敲除或者敲低的操作。这样我们就需要构建表达载体（过表达，敲除或者敲低），并将构建好的表达载体转染至我们的细胞或者实验动物内，进而便可研究我们的基因在细胞或者生物体内所执行的功能和扮演的角色。

       可在构建表达载体的时候 ，我们要如何选择合适自己实验需要的载体呢？载体可分为病毒载体和非病毒载体，病毒载体又分为慢病毒载体、腺病毒载体和腺相关病毒载体等。今天我们就来说说病毒载体中的慢病毒载体。

       一、慢病毒

      逆转录病毒（Retrovirus）：是一种RNA病毒，在复制时需在逆转录酶的作用下首先将RNA转变为cDNA， 再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增。主要包括RNA肿瘤病毒、慢病毒及泡沫病毒等三种亚科。

      慢病毒（Lentivirus）：属于逆转录病毒科，名称源自该种病毒长达数年的潜伏期。

      最经典的慢病毒是由HIV病毒改造而来，而且HIV-1/HIV-2系统也得到了广泛的应用，除了HIV病毒系统以外，后续还有猿类免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）载体系统、猫免疫缺陷病毒（felines immunodeficiency virus, FIV）载体系统、绵羊梅迪-维斯纳病毒（MMV）载体系统和马传染性贫血(EIA）载体系统等。

       慢病毒结构：

      2个调节基因：

    （1）tat基因：反式激活因子，对HIV基因起正调控作用。

     （2）rev基因：病毒蛋白表达调节因子，增加gag和env基因对结构蛋白的表达。

      4个辅助蛋白（附属）基因：

    （1）vif和vpu调节感染性病毒颗粒的产生；

     （2）vpr和nef参与疾病的表现。

      慢病毒的优势：

      1.慢病毒携带的基因组可整合到宿主基因组，使宿主细胞长时间稳定表达外源基因；

      2.可感染分裂和非分裂细胞；

      3.低免疫原性，直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验；

      4.可以更换特异性启动子；

      5.野生型的HIV大小约为9.8 kb，插入片段可长达5-6 kb；

       二、慢病毒载体

      慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。

       慢病毒载体组分：

      慢病毒载体系统：包装成分和载体成分

      产生慢病毒颗粒的辅助成分：慢病毒包装质粒和包装细胞系。

      慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。

      慢病毒包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。

      将包装成分与载体成分的3个质粒共转染包装细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。

      慢病毒包装过程：

      慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂（图1）。

慢病毒包装和侵染细胞的过程（元和生物）

       三、慢病毒的使用和优势

       慢病毒的使用量的取决因素：滴度， 感染体积 ，MOI ，细胞密度

      滴度（Titer）：单位体积液体中有感染能力的病毒或噬菌体数目。单位：TU/mL （活性滴度单位）、copies/mL （物理滴度单位）

      检测方法：定量PCR检测干扰后细胞基因组中外源DNA拷贝数。

      实验原理：慢病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组。；

      MOI（multiplicity of infection）：感染复数或者复感染指数。指感染时病毒和细胞数量的比值。在实验中也将某个细胞达到 80%感染时所需的MOI 值定义为这个细胞的MOI值。加的病毒量(μl)=细胞数×MOI/滴度(…/ml) ×1000。

       慢病毒载体的优势：

      （1）表达时间长：慢病毒可将外源基因整合到宿主细胞基因组上，实现基因长时间稳定的表达，不随细胞分裂传代而丢失，是细胞实验的首选，常用于构建稳转株。

      （2）安全性高：未发现致病性，慢病毒载体改造T细胞用于CAR-T细胞治疗。

      （3）免疫原性低：直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验。

       应用：

      1.基因治疗

      2.转基因动物

      3.基因敲除

      4.药物研究

      5.慢病毒载体能够有效地感染培养的肿瘤细胞、肝细胞、心肌细胞、神经元、内皮细胞、干细胞等多种类型原代细胞和大部分细胞系。

      6.慢病毒的感染具有整合特性，能够将外源基因有效地整合到宿主染色体上，因而可以达到持久性表达，从而构建稳转细胞株，用于基因的细胞功能研究。

      7.快速建立生产目的蛋白的细胞系，非常有前途的真核表达方法。

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