通过LC3-Ⅱ水平看细胞自噬的发生

自噬（autophagy）是在真核细胞中，过量或异常的细胞器被双膜泡隔离并交付给溶酶体/液泡后被降解，回收利用细胞性物质及清除受损细胞器或有害的蛋白质的过程。自噬的过程包括隔离膜（isolation membrane）或自噬前体（pre-autophagosome）的形成及延伸、自噬体（autophagosome）的形成、自噬体和溶酶体融合后形成自噬溶酶体（autolysosome），最终胞内物质降解，产生的降解产物如氨基酸、脂肪酸等可被细胞再利用。

自噬在维持细胞内稳态发挥重要的生物学作用：①应对外源性刺激，自身降解重新获得生长所需营养物质。②细胞自我更新，降解胞内衰老蛋白和细胞器后重新合成蛋白和细胞器。③防御性清除胞内受损大分子物质，维持细胞正常功能。

既然自噬对维持细胞稳态如此重要，那么，自噬检测怎么做呢？说到这里就不得不提到公认的自噬标志物——微管相关蛋白1的轻链3（microtubule-associated-proteinlight-chain-3，LC3）。正常情况下，LC3以未脂化的可溶性形式存在于胞浆中，被称为LC3-Ⅰ，其分子量为18kDa。自噬形成时，LC3-Ⅰ酶解转化成为膜型LC3，又被称为LC3-Ⅱ，其分子量为16kDa。LC3Ⅱ在聚丙烯酰胺凝胶上表现出的迁移率高于LC3-Ⅰ，LC3-Ⅱ与噬小体/自噬溶酶体的数量呈正相关，所以LC3-Ⅱ被广泛地应用于定量细胞自噬的活性。

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LC3与绿色荧光蛋白（GFP）结合成LC3-GFP显示出与LC3相同的过程，并且可通过监控液泡输送和GFP-LC3后续的分解而示踪自噬通量。当自噬通量正常，存在于自噬体内部的GFP-LC3在自噬体膜融解且暴露于液泡水解酶的内容物被裂解。GFP-LC3的蛋白水解可释放出一个完整的GFP部分，因其对降解有相对抗性，可作为自噬产物累积在液泡。自由的GFP水平增加可被检测且可通过Western印迹分析进行定量，并与自噬率相关。GFP是酸敏感型GFP蛋白，由于自噬溶酶体内部的酸性环境，可以导致pH下降、GFP淬灭，因此，GFP的强弱可指示自噬溶酶体形成的顺利程度。除了以上LC3-II检测试剂盒，Cell Biolabs当然还可以提供GFP-LC3表达质粒（cat#CBA-401）：

左侧是pCMV-GFP对照质粒；右侧是pCMV-GFP-LC3表达质粒

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