KEAP1-NRF2相互作用的小分子抑制剂筛选

核因子红细胞2相关因子（Nuclear factor erythroid 2-related factor，Nrf2）是一种转录因子，通过与抗氧化应答元件（antioxidant response element，ARE）区域的启动子结合，增加抗氧化蛋白的表达，从而协调抗氧化和抗炎反应。在基础条件下，Nrf2被细胞骨架的Kelch样ECH关联蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）保留在细胞质中，并促进Nrf2的泛素化和降解。正常情况下，人体内氧化和抗氧化体系基本处于动态平衡。一旦平衡被打破，机体处于过度氧化负荷下抗氧化物质耗竭或活性下降，则过多的活性氧自由基就可能攻击靶器官造成组织器官和生物大分子如DNA、RNA、蛋白质、脂质的损伤。一般情况下，Nrf2定位于细胞质，并与Keap1相互作用，泛素化后被泛素蛋白酶体途径迅速降解。当细胞受到氧化应激时，Keap1蛋白域的结构发生变化，导致Nrf2从Keap1中释放出来，导致Nrf2蛋白不能被降解从而进入细胞核，结合到ARE上，并诱导抗氧化应答基因的转录表达，保护细胞免受氧化损伤。研究表明，运用小分子抑制剂直接阻断KEAP1-NRF2蛋白-蛋白相互作用可调节抗氧化基因的表达，预防正常细胞恶变，发挥抗癌作用，

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Keap1-Nrf2抑制剂筛选试剂盒旨在利用荧光偏振（fluorescence polarization，FP）技术，通过监测荧光标记分子与配体结合时的旋转运动性变化，来鉴定Keap1-Nrf2结合抑制剂。FP是一种用于研究分子相互作用的强大工具。该试剂盒包含足够量的纯化Keap1蛋白、荧光标记Nrf2肽和用于100个结合反应的试剂缓冲液。为了确定抑制剂对Keap1-Nrf2复合物形成的影响，将Keap1蛋白和荧光Nrf2肽与或不与测试抑制剂一起孵育30分钟。使用能够测量荧光偏振的多功能微孔酶标仪测量Nrf2肽的旋转运动性变化。

结果赏析：

左图：Keap1与Nrf2的结合。右图：Nrf2抑制剂抑制Keap1-Nrf2结合。 结合情况使用Keap1:Nrf2抑制剂筛选试剂盒（BPS Bioscience #72020）进行检测。Nrf2抑制剂KI696与Nrf2肽和Keap1在逐渐增加的浓度下孵育。荧光偏振度在λex 485nm，λem 530 nm下使用荧光偏振的多功能微孔酶标仪测量。   

文献案例：

在这项研究中，报道了一种新的6-shogaol衍生物（shogaol噻吩化合物（STC）），通过多种机制（KEAP1独立和依赖）改善了其NRF2活性，降低了与巯基的反应性（可能改善了其生物作用的选择性并减少了毒性），并在肝脏微粒体中具有代谢稳定性。使用可重复使用的催化剂（脯氨酸-脯氨酸二肽）采用新的合成方法，在良好的产率（>85%）和纯度（~95%）下合成了STC。STC具有良好的药物样性质和生物活性，优于6-shogaol。与6-shogaol相比，STC表现出更显著的抗炎作用，通过NRF2依赖和NRF2非依赖机制（未来的研究应进一步阐明这一方面）。在该研究中，他们就是用的BPS Bioscience Keap1-Nrf2相互作用的抑制剂筛选试剂盒来确定STC在抑制KEAP1-NRF2相互作用方面的效果的。

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