钙离子荧光探针专题2——比值型荧光探针

前情回顾：钙离子荧光探针大盘点—助您拍出好钙片

       前面我们介绍了荧光指示剂法可以将Ca²⁺检测的实验与其他技术结合使用，如可以与流式细胞仪、荧光分光光度计、或者荧光显微镜进行联合检测 。紫外光型主要包括Quin-2、Indo-1、Fura-2等，数量较少，可见光型数目较多，包括Fluo-3、钙黄绿素、Rhod-2等。

      荧光指示剂根据测光原理和数据处理的性质又可以分为比值型和非比值型两种类型。其中Fura-2、Benzothiaza、Indo-1和BTC等系列属于比值型,化学荧光指示剂大都为非比值型染料。

       虽然比值型荧光染料较少，但应用广泛，下面介绍几种典型的荧光染料的特点：Fura-2 属于双波长激发指示剂，其激发特性与Ca²⁺浓度有关，当介质中没有Ca²⁺时，其激发峰为380nm，当与钙结合时，激发峰向短波方向340nm处移动，最后分别以340nm、380nm激发,得到发射光的比例，这种比例与细胞内Ca²⁺浓度成正比例的关系，这种染料可以减少染料负载，增强结果的准确性。Fura-2与双波长显微荧光分光光度计联用可以测量单细胞内Ca²⁺的浓度，与流式细胞仪联用可以测定细胞悬液的Ca²⁺的浓度 ，与荧光分光光度计联用测量单细胞内及细胞悬液钙离子的浓度，因为其结果准确，而且不易被漂白，所以是广泛使用的指示剂。

       Indo-1也是一种双波长发射指示剂，单波长激发（340nm）和双波长发射（405nm和506nm）,也可以用荧光比率来反应细胞内Ca²⁺的浓度。它的优点与Fura-2相似，但其漂白作用明显，应用时应该尽量减小狭缝宽度和尽量减少激发光照射时间。 目前最新的荧光指示剂是第三代荧光指示剂Fluo-3,是典型的单波长指示剂，激发波长位于可见光范围内。最大吸收峰位于506 nm,最大发射波长是526 nm，Fluo-3与Ca²⁺结合后其荧光强度比游离时高出40倍左右，从而避免了细胞自身的荧光干扰，作为长波长指示剂，Fluo-3可以用作激光共聚焦成像研究，或者与其他荧光指示剂

      Fura-2和Indo-1的荧光检测

       在适当的条件下通过监测比值型荧光指示剂的波长变化与细胞内游离的Ca ²⁺浓度的变化关系来检测Ca ²⁺浓度是一项出色的技术，我们可以通过观察Fura-2在300 nm至400 nm之间的吸收位移来检测钙离子浓度（同时以约510 nm的固定发射波长）。同样，Indo-1可以被流式细胞仪的氩离子激光器（?350 nm）很好地激发，当与细胞内游离的Ca²⁺结合时，Indo-1的发射波长从?475 nm转变为?400 nm。Fura-2和Indo-1的荧光发射的一个关键特征是分别在?360 nm和?460 nm处存在一个等位点（图1）。此时，两个比值型指示剂的荧光强度均对游离Ca ²⁺的浓度不敏感。另外，等位点的存在预示了正确的实验室操作，因为其他离子的污染或错误的移液会导致等位点的缺少。

      图1. 在含有0-39μM游离Ca ²⁺的溶液中，Fura-2的荧光激发光谱（上）和Indo-1的发射光谱（下）。

      Fura-2和Indo-1衍生物：

      AM 酯：比值型指示器的活细胞加载

       Fura-2和Indo-1比值型指示剂可以以AM酯形式用于活细胞上样，用AM酯标记比值型指示剂有助于其在活细胞完整细胞膜上的被动扩散，一旦进入细胞，非特异性细胞内酯酶就会水解AM酯，从而激活Ca ²⁺敏感指示剂。

      Fura-2和Indo-1：盐衍生物

     Fura-2和Indo-1也可以作为细胞不渗透盐衍生物使用以下方程式确定细胞质中游离Ca ²⁺的浓度：

      [Ca ²⁺ ] _free  = K _d [F-F _min ] / [F _max  -F]

      公式中各字母代表：

      K _d是指示剂的Ca ²⁺解离常数

      F是实验水平下Ca ²⁺指示剂的荧光值

      F _min是在不存在Ca ²⁺的情况下观察到的指示剂的荧光值

      F _max是Ca ²⁺饱和情况下指示剂的荧光值。

      与校准溶液相比，比例指示剂与Ca ²⁺结合光谱性质在不同细胞环境中差异很大。细胞内指示剂的原位校准产生的K _d值通常明显高于体外测定的K _d值，在离子载体存在下将加载的细胞暴露于已知浓度的Ca ²⁺缓冲液中进行原位校准，其中离子载体用于提高细胞内Ca ²⁺的水平，在K _d表1列出了一些钙比例指标的值。

      Fura-8及其衍生物

      AAT Bioquest开发了Fura -8^TM比值型指示剂，以AM酯和盐衍生物形式提供，可改善对细胞内钙浓度的敏感响应。与Fura-2相比，Fura-8 ^TM具有更高的信噪比，同时保持了对Ca ²⁺的相似亲和力（图2）。Fura-8 ^TM的显着优点是其吸收和发射波长在红色光谱方向上移动。Fura-8 ^TM可以在?365 nm（与Ca ²⁺结合）和410 nm（无Ca ^{2 +}）波长下激发，发射波长?525 nm。这样的光谱特性使Fura-8 ^TM可通过相对便宜的大功率LED激发，并与常见的发射滤波器组（例如FITC）兼容。此外，Fura-8 ^TM激发波长的变化使其可与在360 nm以下激发时会发出荧光的有机化合物一起使用，这可能导致错误信号。当使用Fura-8 ^TM时, 我们建议使用Ex / Em = 354/530 nm和415/530 nm进行比值测量。

      图2.分别用Fura-2，AM（Cat＃21020）和Fura-8 ^TM，AM（Cat＃21055）测量的CHO-K1细胞中的ATP剂量反应。将CHO-K1细胞以40,000个细胞/ 100μL/孔在黑壁/透明底部96孔板中过夜接种。将细胞分别与Fura-2，AM或Fura-8，AM钙测定染料上样溶液孵育1小时。

     美国AAT Bioquest Inc.(前身是ABD Bioquest，Inc.)是一家为从事生命科学研究、诊断研发及药物开发的科学家研发、生产和销售生物分析研究试剂和试剂盒的公司。公司致力于光谱学检测领域，包括吸收（颜色），荧光和发光技术。AAT Bioquest的产品帮助全世界的科学家和生物医药研究者更好的了解生物化学，免疫学，细胞生物学和分子生物学等领域。AAT Bioquest会不断介绍新产品，快速的丰富各个领域的产品。

      作为AAT Bioquest Inc.的中国区域代理，艾美捷科技为中国客户提供光谱学检测领域，包括吸收（颜色），荧光和发光技术等全系列解决方案。我们也将一如既往更加努力为国内用户提供快捷、方便的高质量产品，同时更为您售前售后全面技术支持。