Fugene-文献解读-Fugene HD转染试剂将CRISPR/Cas9质粒高效转入PC3细胞

前列腺癌（Prostate cancer，PCa）是全球男性最常见的癌症之一，其致死率也相当高。尽管存在手术、化疗、放疗等多种治疗手段，但这些方法的有效性和安全性仍有待提升。特别是在解决化疗耐药性和减少副作用方面，需要更深入的研究和新的治疗策略。近年来，随着基因编辑技术的发展，通过基因敲除来研究癌症相关基因的功能变得更为直接和高效。 

“CRISPR/Cas9-mediated knockout of Lcn2 effectively enhanced CDDP-induced apoptosis and reduced cell migration capacity of PC3 cells”利用CRISPR/Cas9技术，在高度侵袭性和激素难治性的前列腺癌细胞系PC3中敲除了Lcn2基因，并评估了这一操作对细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响，尤其是在与化疗药物顺铂（CDDP）联合使用时的效果。

为了研究Lcn2在高度侵袭性的前列腺癌细胞系即PC3中的致癌作用，最初通过CRISPR/Cas9技术在PC3细胞中敲除了Lcn2表达。研究的示意图如上图。  

方法

1. 细胞培养与转染

细胞系：使用人前列腺癌细胞系PC3。

培养基：细胞在RPMI 1640培养基（含10%胎牛血清）中，于37°C、5% CO2条件下培养。

转染：利用Fugene HD转染试剂（货号HD-1000， FuGENE? HD Transfection Reagent）将Lcn2 CRISPR/Cas9敲除质粒、同源定向修复质粒或对照CRISPR/Cas9质粒共转染至PC3细胞中。具体步骤包括细胞接种、质粒混合、Fugene HD转染试剂孵育、更换含嘌呤霉素的选择培养基等。  

2. 基因敲除验证

RNA提取与RT-PCR：提取总RNA，反转录为cDNA，通过PCR检测Lcn2的mRNA表达水平。

免疫细胞化学（ICC）：使用Lcn2特异性抗体对细胞进行染色，确认Lcn2蛋白的敲除水平。

酶联免疫吸附试验（ELISA）：通过ELISA试剂盒检测细胞培养上清中Lcn2蛋白的浓度，进一步确认敲除效果。 

3. 细胞增殖与凋亡检测

WST-1试验：利用WST-1试剂检测细胞增殖能力。

克隆形成试验：评估细胞在长时间培养后的增殖潜力。

凋亡检测：通过DAPI染色、TUNEL试验和细胞死亡检测ELISA plus方法评估CDDP处理后的细胞凋亡情况。  

4. 细胞迁移能力检测

划痕试验（Wound Healing Assay）：通过在细胞单层上制造划痕，观察细胞迁移填补划痕的速度。

Transwell迁移试验：评估细胞通过含小孔滤膜的迁移能力。  

实验结果

1. CRISPR/Cas9介导的Lcn2敲除抑制PC3细胞增殖

通过RT-PCR、ICC和ELISA方法确认Lcn2基因在mRNA和蛋白水平上的敲除成功后，发现Lcn2敲除显著抑制了PC3细胞的增殖能力。WST-1试验和克隆形成试验均表明，Lcn2敲除细胞的增殖速度明显慢于对照细胞。  

2. Lcn2敲除增强PC3细胞对CDDP的敏感性

Lcn2敲除后，PC3细胞对CDDP的敏感性显著增强。不同浓度的CDDP处理显示，Lcn2敲除细胞在较低浓度的CDDP下即表现出更强的细胞毒性反应。  

3. Lcn2敲除促进CDDP诱导的细胞凋亡

通过DAPI染色、TUNEL试验和细胞死亡检测ELISA plus方法，均观察到Lcn2敲除细胞在CDDP处理后的凋亡率显著高于对照细胞。这表明Lcn2敲除可能通过促进细胞凋亡来增加PC3细胞对CDDP的敏感性。  

4. Lcn2敲除减少PC3细胞的迁移能力

划痕试验和Transwell迁移试验结果显示，Lcn2敲除细胞的迁移能力显著低于对照细胞。这表明Lcn2在PC3细胞的迁移过程中发挥重要作用。

结论

本研究通过CRISPR/Cas9技术成功敲除了PC3细胞中的Lcn2基因，发现这一操作显著抑制了细胞的增殖能力，并增强了细胞对CDDP的敏感性，促进了CDDP诱导的细胞凋亡。此外，Lcn2敲除还显著降低了PC3细胞的迁移能力。这些结果表明，Lcn2不仅是一个有价值的生物标志物，还可能是前列腺癌治疗的一个新靶点。通过CRISPR/Cas9技术敲除Lcn2，结合化疗药物使用，可能成为一种新的前列腺癌治疗策略。 

Fugene HD转染试剂的优势

在本研究中，Fugene HD转染试剂发挥了关键作用，确保了CRISPR/Cas9质粒高效、稳定地转入PC3细胞。其优点包括：

高效性：Fugene HD转染试剂能够显著提高质粒DNA进入细胞的效率，使得更多的细胞成功接收并表达CRISPR/Cas9系统，从而增加Lcn2基因的敲除效率。

稳定性：该试剂能够稳定地保持质粒DNA在细胞培养液中的分散状态，减少质粒的聚集和降解，确保长时间内细胞能够持续接受质粒DNA的刺激。

低毒性：与其他转染试剂相比，Fugene HD的细胞毒性较低，能够减少对细胞的损伤，提高细胞的存活率和转染后的生理状态，从而确保实验结果的准确性。

易用性：Fugene HD转染试剂的使用步骤相对简单，不需要复杂的操作技巧，适合实验室常规使用。   

因此，Fugene HD转染试剂在CRISPR/Cas9基因编辑实验中具有不可替代的作用和价值，为基因功能研究和疾病治疗提供了新的技术手段。