你不得不了解的荧光免疫斑点FluoroSpot技术

     【前情回顾】

      想同时进行多细胞因子检测，你只需要一个“复联”FluoroSpot

      众所周知，免疫反应是由先天性免疫和适应性免疫细胞之间复杂的相互作用机制协调进行的。适应性免疫也就是后天免疫，其主要包括T淋巴细胞参与的体液免疫和B淋巴细胞参与的细胞免疫。

       而当机体要产生对抗病毒等病原体的永久免疫时，我们主要依靠的是细胞免疫，也就是可以分泌抗体的记忆B淋巴细胞，因为其可以对病毒等病原体保持长久的记忆，当病毒再次入侵机体时，记忆B细胞可以分泌大量抗体去对抗病毒，从而保护机体免受病毒的入侵。大多数情况下，B细胞效应本身并不能独自完成这个过程。细胞免疫与体液免疫是相互配合，保持一致的。

      目前，机体内的抗体滴度是否是一种对抗新冠病毒SARS-CoV-2入侵机体的免疫保护的标志物还存在很大争议（了解更多信息请参见WHO网站）。因为，虽然由T辅助细胞和细胞毒性T细胞诱导的免疫效应在发挥机体保护性的作用方面起着非常重要的作用，但是我们也不要忘记T细胞还具有免疫监视的作用。

     对此，Mabtech公司做了一个初步研究。在研究中，可以原位分析细胞的荧光免疫斑点法FluoroSpot技术发挥了重要作用。FluoroSpot可以高度灵敏地分析细胞所分泌的细胞因子--比流式等这些实验方法的灵敏度还要高出数百倍。FluoroSpot技术可以直接用病毒多肽重复刺激细胞。Mabtech此次研发小组选择了同时分析细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌，因为与单独分析IFN-γ相比，同时分析IL-2，更可以全面评估T细胞对病毒感染反应（Chauvat et al，Hum Vaccin Immunother，2014）。同时，研发小组使用内部开发的SARS-CoV-2 ELISA试剂盒分析研究了每个病人的抗体（IgG）水平，并将其与FluoroSpot数据进行了比较。

      SARS-CoV-2特异性T细胞的数量与抗体滴度成反比

     7个从轻症到中度症状的新冠病毒肺炎康复者的血样（经过PCR确诊）。 提取的PBMC已经新冠病毒（SARS-COV-2）肽库刺激，并以T细胞特异性肽库作为阳性对照。 SARS-COV-2肽库包括：15聚体与11个重叠的棘突蛋白和核衣壳蛋白的S1和S2结构域； JPT肽重叠。T细胞特异性肽库包括：CMV肽库, CEF延伸肽库, CEFTA肽库。T细胞反应是使用IFN-γ/IL-2 FluoroSpot分析（250,000个细胞/孔）在Mabtech IRIS上进行了分析。 此外，使用内部开发的ELISA分析了SARS-CoV-2 棘突蛋白 RBD特异的IgG。

     根据上图，我们得出这样的结果：经SARS-CoV-2多肽库刺激后，所有COVID-19恢复期患者的Th1反应均为阳性。 其中有6个人的SARS-CoV-2特异性IgG水平升高，但其中一名（C7）的IgG水平低于ELISA检测阈值。 有趣的是，这个通过抗体测试评估其COVID-19抗体效应为阴性的患者，其IFN-γ/ IL-2效应却最强。

     所以从这项研究，我们发现一个有意思的现象，抗体滴度与T细胞反应之间的相关性似乎是相反的：抗体反应最低的三个患者（C4，C5和C7），却具有最高的T细胞反应，即FluoroSpot分析中出现最高的IFN-γ/ IL-2的分泌细胞。但是由于，目前各方面的研究受限，我们尚不能得出这种相关性是否与疾病发展非常重要的结论。同样地，我们也还没有与疾病严重程度相关的数据。然而，这些数据为我们提出了一个重要问题：新冠病毒肺炎发病中，T细胞和B细胞之间是相互影响，互相作用的。

     而一篇最新发表的论文（Ni et al，Immunity, 2020) 展示了中和抗体滴度与病毒特异性T细胞数量之间呈正相关，也就是说这种结论暂时与我们的发现相反。这可能是因为受限于样本人群的规模以及其疾病的严重程度等因素。但是，同样在这篇文章中，也有一个康复期的病人样本，抗体水平难以检测到，使用IFN-γ ELISpot试剂盒却检测到了抗病毒作用的T细胞效应。

     如上所述，该研究小组只是展示初步的研究成果。而Mabtech 公司与法国国家健康研究院、法国国家科学研究中心、蔚蓝海岸大学等研究机构的合作的、更大的研究项目还在进行中，以评估了该测定法对COVID-19患者的诊断和预后价值。

     为了更好的帮助广大研究者方便研究新冠病毒肺炎，2020年05月18日Mabtech刚刚推出新冠病毒肽库，SARS-CoV-2 S1 S2 N成分明确的肽库。该肽库已通过FluoroSpot和ELISpot的验证，可以用于确诊的新冠病毒康复患者的外周血单核细胞（PBMCs）体外刺激。而这些多肽的选择是基于最新发表的文章Ahmed et al. (Viruses) 2020 。在这篇文章中作者描述了具有T细胞阳性反应的SARS-1抗原表位。甚至有一些表位对SARS-1 和 SARS-2都具有效应。这些抗原表位即是建立肽库的基础。SARS-CoV-2 S1 S2 N成分明确的肽库共含有41个多肽，是基于棘突蛋白（S1和S2）和核蛋白（N）合成的多肽，分别是31种MHC-I肽和10种MHC-II肽。

上数据了！

经FluoroSpot验证的数据

     Purified PBMCs prepared from three individuals previously PCR-confirmed for SARS-CoV-2 and PMBC from one pre-COVID-19 healthy control were stimulated with Mabtech's SARS-CoV-2 S1 S2 N defined peptide pool (250,000 cells/well). PHA stimulation (50,000 cells/well) was used as positive control stimulus. Unstimulated cells (250,000 cells/well). The T cell response was analyzed on Mabtech IRIS using an IFN-γ/IL-2 FluoroSpot assay。

经ELISpot验证的数据

     Human IFN-γ ELISpot. CD8+ cells were purified from whole blood using CD8 FAB-TACS (IBA Lifesciences). Cells (300,000 cells/well) were added to a pre-coated Human IFN-γ ELISpot plate and incubated overnight in the presence or absence of Mabtech’s SARS-CoV-2 S1 S2 N defined peptide pool.

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