全攻略—流式同型对照抗体

实验方案设计的第一步就是设置对照组，如何保证实验操作的可行性以及实验结果的可靠性，设置合理的对照组是关键。特别是阴性对照，不同的实验类型阴性对照都包括好几种，分分钟让你晕头转向，今天我们就来说说流式实验的阴性对照。

我们都知道流式实验是利用流式细胞仪激发细胞上结合的荧光素发射荧光，进一步通过对荧光信号的分析就可以间接反映样品细胞的物理化学特征。但是产生的荧光都是靶标特异性的吗？当然不是。发射荧光不仅荧光素能够在激光的激发下产生荧光，细胞表面的某些分子或者结构也能够产生类光，这种荧光相对于荧光素产生的荧光较弱，而且与细胞表面的特异抗原分子没有相关性，被称为非特异性荧光。在特定的激光激发下，细胞表面不结合流式荧光素时也会产生荧光信号。

通常地，每一种细胞都会产生非特异性荧光，流式检测时得到的荧光信号是细胞本身的非特异性荧光和来自于细胞表面结合的荧光素的特异性荧光叠加得到的结果。所以分析流式结果时，不能因为得到了荧光信号就判断细胞表面肯定结合有相应的荧光素，从而得出细胞表达相应的抗原分子的结论，而应该比较该荧光信号与细胞的非特异性荧光，如果得到的荧光信号大于非特异性荧光，说明得到的荧光信号部分来源于荧光素的特异性荧光，就可以得出细胞表达相应的抗原分子的结论。

所以，确定与荧光素无关的细胞自身的非特异性类光的强弱非常重要，而设立阴性对照就是为了确定细胞的非特异性荧光。

话不多说，看图，如上图这3类阴性对照是流式分析比较全面的阴性对照：

第1类“negative”表示的是不加任何荧光素偶联抗体时得到的荧光信号，因为没有标记任何类光素，所以这组得到的荧光信号与荧光素无关，与细胞抗原分子CD69是否表达无关，得到的荧光信号代表的是非特异性荧光信号；

第2类“抗CD69”表示的是用抗CD69抗体标记样品细胞后得到的类光信号，虽然抗CD69抗体能修与细胞表面的CD69抗原分子结合，但是抗CD9抗体没有偶联荧光素，所以得到的荧光信号也与细胞表面是否表达有CD69分子无关，得到的荧光信号代表的也只是细胞本身的非特异性荧光信号，这种对照用于排除抗体的干扰；

第3类“IgG1-PE”表示的是标记与抗CD69抗体同种属（来源于同一物种）且同类（抗CD69-PE中的抗体IgG1类的）的非特异性抗体（IgG1）与PE荧光素偶联的同型（isotype）对照抗体（IgG1-PE）后，得到的荧光信号，这种就属于同型对照，其不能与细胞表面的CD69发生特异性结合，所以细胞表面不会结合有IgG1-PE，最后得到的荧光信号是代表细胞本身的非特异性荧光，不属于PE荧光素产生的特异性荧光信号，这种同型对照用于排除荧光素的干扰。

以上3种阴性对照，并不用全部设置齐全，一般只需要设置1种阴性对照就可以，其中第3种同型对照是最常规的阴性对照设置法。

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部分结果图展示：

使用小鼠IgG3同种型对照（PPV-07）DyLight®650抗体（样品中浓度为5ug/ ml）对人外周血进行的流式细胞仪表面非特异性染色模式。

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