体外血管生成实验怎么做？内皮血管生成剂盒解决方案

血管生成（Angiogenesis）是指从已有的毛细血管或毛细血管后静脉发展而形成新的血管。无论原发性肿瘤还是继发性肿瘤，一旦生长直径超过1~2mm，都会有血管生成。这是由于肿瘤细胞自身可分泌多种生长因子，诱导血管生成。多数恶性肿瘤的血管生成密集且生长迅速。因此，血管生成在肿瘤的发展转移过程中起到重要作用。体外的血管生成实验能很好的模拟肿瘤的血管发生过程，并且适合研究药物对这一过程的影响实验。

在血管生成过程中，内皮细胞破坏周围的基底膜，向血管生成刺激物迁移，增殖形成新的血管，并重组以形成必要的三维血管结构。在存在血管生成剂或抗血管生成剂的情况下，体外检测被广泛用于研究这些功能。目前，对于血管生成的研究，已建立有多个体内（in vivo）模型。如鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型，基质胶塞分析（Matrigel Plug Assay）、角膜血管再生分析（Corneal Angiogenesis Assay）等模型均能很好的评估血管生成应答和再生能力。然后这些体内模型都具有共同的缺陷：耗时耗力，并且需要成熟的技术和试验经验。

Cell Biolabs开发出的Endothelial Tube Formation Assay Kit内皮血管生成试剂盒以EHS肿瘤细胞分离的基质ECM组分胶作为三维培养基质，能让血管内皮细胞在18小时内形成血管。这种快速的检测血管再生能力的方案较真实的模拟了细胞生长和血管再生的环境，因此可用于血管再生能力的检测及血管生成抑制剂的快速筛选等。

在ECM胶上生成人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管：左图-组织培养板上HUVEC细胞；右图-ECM胶上血管生成

Cell Biolabs的内皮血管生成剂盒提供了一个自动化的体外血管生成能力的方案。试剂盒内提供了ECM基质胶、荧光染料及缓冲液等。其操作步骤是将细胞铺设在基质ECM组分胶上，培养4-18小时后在光学显微镜下观察管道生成情况，包括管道的长度和节点数等。另外，试剂盒内还提供了荧光染料，可快速对细胞和新生管进行荧光显色观察和分析。

常见问题：

Q1. 这个试剂盒可以用于HUVECs之外的细胞吗？

A1. 该试剂盒可用于任何内皮细胞

Q2. 试剂盒中ECM胶溶液的组分是什么？

A2. ECM 凝胶溶液与基质胶相同，是从EHS小鼠肉瘤中分离得到的一类ECM，含有主成分层粘连蛋白以及IV型胶原蛋白、肝素硫酸盐糖蛋白、巢蛋白和其他次要成分。 它确实含有生长因子，但含量未知。

Q3. 该测定法是否需要血管生成介质？

A3. 血管生成介质对于该测定不是必需的，因为即便不添加任何介质血管也能生成。由于血管是在没有额外介质的情况下形成的，因此该检测方法是研究抑制血管生成的良好系统，但不利于研究血管生成的增强效应。我们在此分析试剂盒中不包括任何介质，但如果客户要使用，则应确定所用化合物的最佳浓度。良好血管形成的关键是每孔使用足够健康的HUVEC细胞，例如50,000个细胞/孔。通常每孔更多的细胞比更少的细胞会导致更好的血管形成。

Q4. 如何优化血管生成？

A4. 1.延长培养时间至12小时或者过夜。一般过夜培养的细胞会形成较好的血管；2.ECM凝胶在使用之前应该完全解冻：在加入细胞培养孔之前，可以将凝胶在4℃条件下解冻24小时。凝胶形成需要 30分钟到1 小时，但是如果需要，可以将平板在 37°C下孵育1小时以形成凝胶。凝胶在使用前完全凝固很重要，因为如果它是半固体，细胞的尺寸将不同，细胞与细胞之间的相互作用会减少，从而减少血管的形成；3.添加细胞后，不应移动培养板，因为这会干扰血管的形成。

Q5. 如何避免在培养孔的边缘形成血管？

A5. 孔边缘上的血管形成可能是由于分布在边缘的细胞浓度较高。 这表明孔中没有足够的细胞，应增加细胞数。

Q6. 你能推荐抑制血管生成的药物吗？

A6. 抑制剂的例子是：1. MMP抑制剂：GM6001 ; 2. PI3K抑制剂：渥曼青霉素

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