冠状病毒“生命”周期中的细胞骨架互作

       冠状病毒超家族（Coronaviridae）包括几类具有大RNA编码基因组的人类病原体，例如流感，普通感冒和病毒性脑炎，它们被分为α，β和γ冠状病毒家族，并进一步分为A，B ，和C型别。COVID-19被归类为与SARS-CoV高度相似的B型冠状病毒，因此，它最近更名为SARS-CoV-2。尽管人们在1960年才记录了β冠状病毒家族的第一批成员，但该家族中新增的人类强致病性病原体数量在过去20年中迅速增加，目前已达到6个，最新的有SARS（严重急性呼吸系统综合症，2002年），MERS（中东呼吸系统综合症，2012年），以及目前正在流行的COVID-19 / SARS-CoV-2。

      在这里，我们一起来了解一下病毒“生命”周期与细胞骨架的相互作用的四个阶段：

       第一阶段：病毒入侵

      冠状病毒感染的第一阶段是Spike（S）蛋白质介导的通过Spike（S）蛋白质附着到细胞表面的神经酰胺酸部分（具有9个碳原子的酸性碳水化合物）或硫酸乙酰肝素。这种感染策略非常有效，因为在所有哺乳动物细胞表面上存在许多类型的受体分子，从而为质膜附着创造了丰富的条件。结合后，病毒颗粒通过调节FAK / Cofilin / Rac / Cdc42途径主动重新排列细胞骨架。

      吕等人在体外对小鼠脑神经元（N2a）细胞进行冠状病毒PHEV给药后，显示出丝状伪足，片状脂质体和应激纤维比例随着时间波动。在5min内，应激纤维被消耗殆尽，而丝状伪足占主导，占总鬼笔环肽荧光信号的80％。在20-40min之间，lameopodia与丝状伪足平分秋色，最终在60min时，比例恢复到接近正常水平，即60％的信号是应激纤维。尽管这是从宏观角度进行观察，但这在纳米尺度上表明病毒体可能会创建一个调节其自身进入的局部环境。在另一份研究报告中，Owczarek等人对人类大肠腺癌细胞（HCT-8）进行冠状病毒OC43给药来研究内陷法，膀胱切除术对F-Actin功能影响。Milewska等人也描述了类似的病毒入侵研究，通过其他机制，例如小窝依赖的内陷或胞饮作用，病毒感染率取决于细胞表面的病毒载量。细胞入侵过程中也会将病毒体包被在靠近细胞核的囊泡中。

      冠状病毒进入细胞-复制-组装-释放的示意图（改编自Simpson和Yamauchi，2020）

      用PHEV冠状病毒处理或未处理的HCT-8细胞5min，固定细胞并用Acti-stain 488（绿色，细胞骨架），抗PHEV外壳蛋白（红色）和DNA（蓝色，Hoescht）染色。B图：感染冠状病毒，A图：未感染。

      Note：感染样本中细胞外围的染色水平很高，表明有片状脂膜病和丝状伪足（窄峰）。与未感染的细胞样本相比，这表明细胞质染色颜色深，表明有应激纤维。（上图由He Wenqi教授提供，来自Lv et al.2019）。

       第二阶段：转运

      在第二阶段，一些研究揭示了肌动蛋白和微管蛋白都是细胞内转运的互补细胞骨架成分。Owczarek等人探讨了F-Actin在细胞内定位中的功能，jasplakinolide（一种细胞可渗透的F-肌动蛋白稳定化合物）抑制了病毒入侵过程中病毒颗粒的质膜结合，而cytochalsin D（一种F-actin的解聚化合物）并没有抑制病毒的入侵，但扰乱了病毒体从周围核到细胞质区域的正常定位。冠状病毒刺突蛋白C末端肽（S蛋白）以冠状病毒株特异性方式与几种β-tubulin亚型结合，混乱的肽显示结合不是由于随机的离子电荷相互作用。因此，病毒体在细胞内转运是利用多种细胞骨架结构蛋白来进行导航并定位到细胞内的特定区域的。

       第三阶段：组装和成熟

      病毒体被转运到核周区域后，冠状病毒RNA从囊泡和病毒粒子中渗出，进入细胞核进行逆转录和复制。DNA复制子随后被转录称RNA，并从细胞核进入高尔基体/ ER /微管组织中心。最初，核衣壳（N）蛋白与RNA拷贝结合并与囊泡膜结合，然后N和E蛋白进一步成熟，这是组装基本病毒样颗粒（VLP）所需的。如果Spike（S）蛋白是共表达的，则它会掺入病毒颗粒中。在多种细胞骨架和膜调节蛋白协同作用下（例如HDAC6，泛素和Rab GTPases）通过浓缩包装组分来辅助组装。

       第四阶段：释放

      冠状病毒核衣壳或棘突蛋白与GFP的遗传融合使得可以通过荧光显微镜跟踪非感染性病毒颗粒。Siu等使用这种技术监测SARS-CoV释放，发现了融合成多颗粒团块的囊泡。该转运对布雷菲德菌素A敏感，表明正在利用分泌途径。其他研究发现诺考达唑可有效抑制病毒体向质膜的转运，表明微管是病毒释放出口的重要组成部分。Rab11涉及到KHC绑定以进行微管运输，然后与肌球蛋白结合，以帮助横穿眼周肌动蛋白基质并从细胞中释放出来。

       小结：

      总的来说，冠状病毒通过质膜附着和内陷进入细胞的方式有很多种，随后，肌动蛋白，微管蛋白及其化学机械动力中的动力蛋白，动力蛋白和肌球蛋白细胞骨架成分都需要进行细胞内转运到正确的位置进行复制。逆转录和转录后，将正链RNA包装在高尔基体/ ER /微管复合体的支架上。囊泡包裹的病毒粒子沿着微管移动，然后与质膜融合并逃出细胞。冠状病毒研究中的许多方法都使用试剂，在这里我们为您推荐荧光鬼笔环肽，微管和肌动蛋白抑制试剂盒，动力蛋白，驱动蛋白，以及各类小G蛋白（Rac，Cdc42）活化测定研究工具。

      冠状病毒研究中有许多未解决的问题。例如，病毒体是如何通过质膜相互作用调节细胞骨架以协调其进入？单个病毒体可以自己进入细胞吗？将肌动蛋白和微管细胞骨架用于不同功能的意义何在？与流行性感冒和普通感冒相比，这种病毒为何能躲避免疫系统追踪这么久？这些问题的解答无疑将在将来给我们带来更多的认知和可能的药理学突破。

      G-LISA 活化检测试剂盒：

       鬼笔环肽：

       Actin生化试剂盒：

      Tubulin生化试剂盒：

      参考文献：

     1.Gorbalenya, A.E., Baker, S.C., Baric, R.S. et al. The species Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus: classifying 2019-nCoV and naming it SARS-CoV-2. Nat Microbiol (2020). https://doi.org/10.1038/s41564-020-0695-z.

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     3.Ren et al. 2015. Genetic drift of human coronavirusOC43 spike gene during adaptive evolution. Scientific Reports, 5, 11451.

     4.Lv et al. 2019. Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus activation of the integrin a5b1-FAK-cofilin pathway causes cytoskeletal rearrangement to promote its invasion of N2a cells. J. Virol. 93 (5), 1-19. doi: org/10.1128/JVI.01736-18.

     5.Owczarek et al. 2018. Early events during human coronavirus entry to the cell. Scientific Reports, 8, 7124, 1-11. doi: 10-1038/s41598-018-25640-0.

     6.Milewska,A.et al. 2014. Human coronavirus NL63 utilizes heparan sulfate proteoglycans for attachment to target cells. J Virol 88, 13221–13230, https://doi.org/10.1128/JVI.02078-14.

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