钙离子荧光探针大盘点—助您拍出好钙片

钙离子在许多生理过程中起着复杂的作用。例如，细胞内钙离子在促进神经元从神经元中释放神经递质的信号转导途径中必不可少，并参与所有肌肉细胞收缩所需的机制。细胞离子浓度受被动和主动离子通道和泵的调节。离子通道和泵的故障可能导致离子浓度调节不当，从而产生不利于正常细胞功能的不利条件。

钙离子浓度研究领域中常使用钙离子荧光探针与钙离子的特异性结合来观察细胞内钙离子浓度水平的变化，此类探针未结合Ca²⁺前几乎无荧光，结合Ca²⁺后，荧光强度显著增强，所显示光谱可被荧光显微镜、流式细胞术、荧光光谱法以及荧光酶标仪等多种方法检测。

常用的Ca²⁺荧光探针根据波长的不同，分为两大类：

1.可见光激发Ca²⁺荧光探针

与紫外光激发的荧光探针相比，可见光激发Ca²⁺探针具有以下特点：

a.适用于大多数的激光共聚焦测钙系统，包括共聚焦激发扫描显微镜以及流式细胞仪等。

b.具有更强的染料吸收性能，使得更低浓度的探针即可成功检测Ca²⁺变化，从而降低了对活细胞的光毒性。

c.Ca²⁺依赖性荧光强度增强，对Ca²⁺变化水平检测敏感度更高。

d.降低样品自荧光以及光散射的干扰。

e.兼容光激活探针以及UV-激发试剂，因此更方便于多参数检测。

f.无光谱偏移。

最受欢迎的可见光激发Ca²⁺荧光探针：

1）Fluo-3

Fluo-3是最常用的可见光激发Ca²⁺荧光探针，较高的Ca²⁺结合力可捕捉细胞内Ca²⁺信号的动力学变化，使用于多种流式细胞术相关实验，如笼锁Ca²⁺螯合剂光活化、第二信使、神经传导物质研究以及细胞水平的药物筛选等。Fluo-3游离配体几乎是非荧光性的，其荧光不会随钙离子浓度升高而增强。但是，当它与细胞内钙离子结合后可以产生较强的荧光，荧光会增加60至100倍，最大激发波长为 506nm，最大发射波长为 526nm。实际检测时推荐使用的激发波长为488nm左右，发射波长为525～530nm。可以使用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化。

2）Fluo-4

Fluo-4是钙指示剂Fluo-3的升级版本，主要变化为后者分子上的两个氯原子被Fluo-4上的氟所取代，该结构上的微小变化使Fluo-4,AM加载更快，在相同浓度下检测信号更强。

3）Rhod-2

Rhod-2是另一种可见光激发的高亲和力Ca²⁺指示剂，与其他可见光激发荧光探针如Fluo-3/4相比，Rhod-2具有长波长，更适用于检测具有较高自荧光现象的细胞和组织内钙离子水平以及检测由光感受器和笼锁Ca²⁺螯合剂光激活导致的钙离子释放。

为什么许多荧光探针会有R-AM或者钾盐形式提供？
 

以Fluo-4和Fluo-4, AM为例：

常规的荧光探针如Fluo-4是极性大的酸性化合物，无法进入细胞内。此时，若想做细胞内染色，需要通过膜片微电极（patch pipette），显微注射（microinjection），胞引作用加载试剂等手段，辅助实现药物加载，非常繁琐。为此，而通过在Fluo-4的负性基团上结合乙酰氧甲酯（AM），该单一的变化既增加了酯溶性又消除了负电荷，极大的提高了细胞渗透性。只需要把细胞孵育在含药物的培养液中，即可实现加载，非常省事。而一旦Fluo-4 AM进入细胞后，酯化钙离子荧光探针被酯酶水解，恢复Fluo-4，在胞内完全发挥其正常生理功能。

2.紫外光激发Ca²⁺荧光探针

Fura-2和Indo-1均属紫外激发Ca²⁺荧光指示剂，也是目前最常用的钙比率测量荧光探针。与第一代染料Quin-2相比，Fura-2和Indo-1发出更强的荧光，在生理pH范围内对pH变化不敏感。与Mg²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺等二价金属离子相比，对Ca²⁺有更高的选择性，因此得到了广泛应用，同时作为双波长荧光染料在标定Ca²⁺浓度时不再单纯依靠荧光强度的变化。

Fura-2是双激发波长荧光染料，Indo-1是双发射波长荧光染料，均采用比率测量方法，该方法可以消除不同细胞样品间荧光探针装载效率的差异，荧光探针的渗漏，细胞厚度差异等一些误差因素。Fura-2特别适合于数字成像显微镜，使用该设备可更方便的调整激发波长，使探针结合钙离子后在300-400nm的激发波长范围内扫描Fura-2的吸收偏移，在510nm处检测发射波长。相比之下，Indo-1更倾向于流式细胞术检测，使用该设备可实现在氩离子激光器的351-364光谱范围内单一波长的激发，在400nm和480nm的波长处分别检测结合钙离子和未结合钙离子的荧光信号，通过二者的比值确定钙离子的浓度。Fura-2,AM和Indo-1,AM分别是Fura-2和Indo-1的乙酰氧甲酯（AM）衍生物，具有活细膜渗透性。

其他钙离子荧光探针：

1）.腔肠素钙离子荧光探针：

腔肠素（Coelenterazine native），又称腔肠素游离酸，是海肾荧光素酶（Rluc）和Gaussia荧光素酶（Gluc）等多种荧光素酶的作用底物，也是水母发光蛋白的辅助因子，应用非常广泛，可用于检测活细胞中钙离子浓度.

水母发光蛋白复合物（Aequorin）由22kDa的水母蛋白（Apoaequorin protein）、分子氧和底物腔肠素组成。只有当钙离子（Ca2+）与该复合物结合后，腔肠素才能被氧化生成高能量产物Coelenteramide，同时释放出CO2和蓝色荧光(~466 nm）。正是此Ca2+依赖性的反应过程（见图1），使得腔肠素非常适用于监测活细胞内钙离子水平。

与常规的荧光钙离子指示剂相比，其主要具有以下几个优点:

a.能检测较大范围的钙浓度 – 从0.1 μM至 >100μM；

b.样品无自体荧光，背景荧光低于使用荧光钙离子指示剂；虽然信号比使用荧光钙离子指示剂弱，但是通过成像仪器可以得到更高的信噪比，因此具有更高的灵敏度。

c.水母发光蛋白复合体能够稳定维持在细胞内，使其能够进行数小时至数天的钙离子监测。

2). 钙离子荧光探针Cal-500

钙离子荧光探针Cal-500 , 钾盐是美国AAT Bioquest生产的钙离子荧光探针，Calbryte 520，Calbryte 590和Calbryte 630提供最强大的均匀荧光测定工具，用于检测细胞内钙动员。与现有的钙指示剂（如Fluo-3 AM，Fluo-4 AM和Rhod-2 AM）相比，这些钙敏感染料明显更亮，并提供更高的信噪比，大大提高了细胞内保留和负载效率。表达通过钙发出信号的GPCR或钙通道的细胞可以预装载可以穿过细胞膜的Calbryte 520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM。一旦进入细胞内，Cal520 AM，Calbryte 590 AM或Calbryte 630 AM的亲脂性阻断AM基团被细胞内酯酶切割，产生带负电荷的荧光Calbryte 染料，留在细胞内.

美国AAT Bioquest Inc.(前身是ABD Bioquest，Inc.)是一家为从事生命科学研究、诊断研发及药物开发的科学家研发、生产和销售生物分析研究试剂和试剂盒的公司。公司致力于光谱学检测领域，包括吸收（颜色），荧光和发光技术。AAT Bioquest的产品帮助全世界的科学家和生物医药研究者更好的了解生物化学，免疫学，细胞生物学和分子生物学等领域。AAT Bioquest会不断介绍新产品，快速的丰富各个领域的产品。

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