永生化细胞的工作流程及质量控制考虑

细胞永生化是癌变的必经途径，通过人为干涉如放射处理、端粒酶激活、病毒基因转染等方法实现。永生化细胞具有科研价值，如作为研究细胞增殖、分化、凋亡、衰老等的理想模型，节省分离细胞的周期和成本，是研究肿瘤发生机制的重要模型，并可建立稳定细胞库提供一致且可重复的实验结果。

基本的细胞系永生化工作流程：

细胞永生化的方法：

细胞自发永生化的几率非常小，于人类细胞就更为罕见。

人为干涉让细胞永生化的方法包括：放射处理、端粒酶激活、病毒基因转染、原癌基因激活、抑癌基因抑制等。其中，听过慢病毒感染使细胞过表达猴肾病毒SV40 T抗原或人端粒酶逆转录酶hTERT基因，是Z常用的两种细胞永生化的方法。

方法A：端粒酶逆转录酶蛋白（TERT）表达

TERT蛋白是端粒酶的催化亚基，在大多数体细胞中通常不活跃。在这种方法中，您可以将编码人类端粒酶逆转录酶（hTERT）蛋白的cDNA插入到您感兴趣的原代细胞中。当hTERT被外源性表达时，细胞能够维持足够的端粒长度以避免衰老。这是最近开发用于细胞永生化的方法。

方法B：病毒致癌基因

病毒致癌基因，如SV40病毒的大T抗原或HPV的E6/E7致癌基因，可以通过抑制肿瘤抑制基因（例如p53和Rb）来实现永生化。这种方法比方法A更快地生效，但可能会改变一些细胞的特性。

在许多情况下，单独使用方法A和B可能不足以成功实现永生化。最近的研究发现，共同表达hTERT和病毒致癌基因具有更高的成功率，并产生更真实和正常的细胞模型，具有明确定义的遗传背景。

艾美捷永生化细胞的常见方法：

试剂 机制 ABM可提供的形式

SV40T Antigen Suppresion of p53 and Rb genes Lentivirus, Adenovirus, Retrovirus

p53 siRNA Knockdown of p53 tumor suppression gene siRNA Lentivirus

Rb siRNA Knockdown of Rb tumor suppression gene siRNA Lentivirus

Ras Suppression of Rb Lentivirus

C-myc T58A Suppression of p53 Lentivirus

Bmi1 Inhibition of p16/Rb pathway Lentivirus

CDK4 Suppression of p16/Rb pathway Lentivirus

HPV 16 E6/E7 Inhibition of p16/Rb pathway Lentivirus

EBV Viral oncogene -

hTERT Elongation of telomeres Lentivirus, Adenovirus, Retrovirus

细胞系质量控制考虑

太好了！在这个阶段，您已经生成了一个永生化细胞系。但是，在您开始在项目中使用您的细胞系之前，有一些重要的质量控制检查您可以进行，以确保您的细胞系处于完美状态。

A.您的细胞系表征

每次永生化后，您应该始终检查您的细胞是否具有适当的标记，以及细胞的功能，以确保它代表您所使用的原代细胞。当您研究细胞途径时，这一步尤为重要，因为您不希望永生化步骤改变了特定途径、功能或细胞的表型。 例如，如果您计划使用您的细胞进行细胞毒性测定，那么使用您的永生化细胞与原代细胞一起进行细胞毒性测定是个好主意，以确保您新永生化的细胞对刺激的反应与它们的原始细胞相似。

B.传代和转基因表达测试

将您的细胞传代至少30次，以证明转基因已稳定表达，并观察它们的生长速度已提高，密度能力已增加。

C.STR分析

正如本文开头提到的，验证您的细胞系身份至关重要，因为可能会发生交叉污染或种群混合的问题。例如，根据《科学》杂志上发表的一篇论文，广泛用于实验室的著名HeLa细胞被发现污染了许多细胞系，包括Hep-2和INT407细胞系。

识别细胞系的黄金标准是短串联重复（STR）分析。STR分析是一种方法，其中在特定位点的短串联DNA重复与标准参考配置文件进行比较。细胞系的STR分析可以用来确认其身份，定期进行STR分析是个好主意，以确保您的细胞系没有随着时间的推移受到污染。

为了应对细胞系误识别事件，资助机构如NIH现在要求在资助申请中使用的细胞系进行STR分析，许多期刊也开始鼓励这个关键的质量控制检查。

D.支原体和病原体检测

最后，始终测试微生物污染物，如真菌、细菌和支原体是个好主意。特别是支原体，是细胞培养实验室中Z常见的污染物之一。通常很难通过显微镜下的视觉检查来检测支原体。然而，这种细菌可以影响细胞的增殖，改变其基因表达谱，并可能扭曲您的实验结果。有许多试剂盒可用，例如abm的PCR支原体检测和清除试剂盒，可以轻松检测并清除50多种类型的支原体。