Cell子刊推荐：ADC位点特异性、高效稳定偶联，细菌转谷氨酰胺酶 (mTG) 来帮忙！

标题为“Site-specific antibody conjugations using bacterial transglutaminase and the Diels-Alder cycloaddition reaction”，作者为Thomas Nittoli等人，发表在《Cell Reports Physical Science》上，文章介绍了一种两步连续的偶联方法，结合了细菌转谷氨酰胺酶/微生物谷氨酰胺转氨酶（mTG， Microbial Transglutaminase）的位点特异性和Diels-Alder（DA）化学的稳定性，以生成具有良好物理化学性质的稳定抗体偶联物。

抗体-药物偶联物（ADCs）已经成为一类强大的靶向生物制剂。目前所有11种美国食品药品监督管理局（FDA）批准的ADCs都是基于随机偶联的，但越来越多的证据表明，位点特异性ADCs有潜力提高治疗指数。

传统的制备方法仍存在一些局限性，需要进一步改进：

1. 随机偶联导致非均一性：传统方法主要通过随机偶联将药物连接到抗体上，这导致产物非均一性，药物负载量（DAR）和抗体负载量（LAR）难以控制，影响 ADCs 的药代动力学和药效学特性。

2. 体外稳定性差：一些传统方法，如硫醇-马来酰亚胺偶联，形成的硫代缩酮键在体内容易发生逆转 Michael 加成反应，导致 ADCs 稳定性下降，药物释放提前，从而影响疗效和安全性。

3. 聚集倾向增加：氨基酸残基的修饰，如赖氨酸和半胱氨酸的偶联，会增加 ADCs 的聚集倾向，导致免疫原性增强，安全性降低。

4. 制备过程复杂：一些传统方法需要使用危险试剂或特殊条件，如叠氮化物和高能反应，这增加了制备过程的复杂性和成本，限制了大规模生产。

5. 药效窗口有限：传统方法制备的 ADCs 往往存在药物释放不理想的问题，导致药物在肿瘤组织中的浓度不足或非靶组织暴露过多，限制了药效窗口。

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TG（mTG, Microbial Transglutaminase）-DA 偶联方法的优势：

• 位点特异性： 通过 TG 酶（mTG, Microbial Transglutaminase）将药物连接到抗体上的特定谷氨酰胺残基，保证了药物负载的均一性。

• 稳定性： DA 环加成反应形成的碳-碳键比酰胺键更稳定，减少了药物过早释放的风险。

• 反应条件温和： 反应在水相中进行，无需使用危险试剂，安全性高。

• 亲水性： 偶联产物相对亲水，降低了聚集的风险。

• 可扩展性： 可以用于多种药物和抗体，并实现多种药物负载模式。

• 双偶联： 利用分支二烯可以实现对抗体进行两次偶联，从而实现多种药物负载模式。

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微生物谷氨酰胺转氨酶, mTG, Microbial Transglutaminase应用前景：

1、细胞毒性药物 ADC：

1）抗肿瘤药物： 将 MMAE、DM1、SN-38 等细胞毒性药物偶联到抗体上，用于靶向治疗癌症。 

2）免疫毒素： 将假单胞菌外毒素 (PE) 等免疫毒素偶联到抗体上，用于靶向杀伤肿瘤细胞。

2、非细胞毒性药物 ADC：

1）抗生素： 将利福平、万古霉素等抗生素偶联到抗体上，用于靶向治疗细菌感染。 

2）抗真菌药物： 将两性霉素 B 等抗真菌药物偶联到抗体上，用于靶向治疗真菌感染。

3）抗病毒药物： 将利托那韦、达芦那韦等抗病毒药物偶联到抗体上，用于靶向治疗病毒感染。

3、其他应用：

1）荧光标记： 将荧光染料偶联到抗体上，用于免疫荧光成像。 

2）放射性标记： 将放射性同位素偶联到抗体上，用于放射免疫治疗。

4、双偶联 ADC：

1）多种药物负载： 将两种或多种药物偶联到抗体上，用于提高治疗效果或克服耐药性。 

2）多靶点治疗： 将两种或多种抗体偶联到药物上，用于同时靶向多个肿瘤相关抗原。

5、定制 ADC：

1）根据患者个体差异设计 ADC： 例如，根据患者的肿瘤基因表达谱选择合适的抗体和药物进行偶联。

2）开发新型的 ADC 平台： 例如，将 TG-DA 偶联方法与其他技术相结合，开发出更具特异性和安全性的 ADC。 

为什么选择微生物谷氨酰胺转氨酶, mTG, Microbial Transglutaminase进行抗体偶联？

• 位点特异性：mTG, Microbial Transglutaminase能够催化特定的氨基酸残基（如谷氨酰胺）与含有胺基的分子之间形成稳定的酰胺键。这种特异性使得TG在抗体偶联中可以精确地在预定的位点引入药物或其他分子，从而提高ADCs的均一性和疗效。

• 稳定性：与传统的随机偶联方法相比，mTG, Microbial Transglutaminase介导的偶联可以生成更稳定的ADCs。这是因为mTG, Microbial Transglutaminase催化的反应生成的酰胺键在生理条件下非常稳定，不易被水解。

• 多功能性：mTG, Microbial Transglutaminase不仅能够偶联小分子药物，还能够偶联各种不同的分子，如荧光标记、酶、甚至是其他蛋白质，这为开发多功能的生物制剂提供了可能。

• 反应条件温和：mTG, Microbial Transglutaminase催化的反应通常在温和的条件下进行，不需要极端的pH值或高能量的试剂，这有助于保持抗体的活性和稳定性。

• 可扩展性：mTG, Microbial Transglutaminase介导的偶联方法具有很好的可扩展性，适合从小规模实验室研究到大规模工业生产的转换。

• 安全性：mTG, Microbial Transglutaminase作为一种酶，其催化的反应通常被认为是安全的，不会产生有害的副产品。

• Zedira公司的mTG, Microbial Transglutaminase：文章中特别提到使用了Zedira公司的TG，这可能是因为该公司提供的TG具有高纯度和活性，或者具有特别适合于本研究的特定特性，如稳定性、特异性或易于大规模生产等。

• 创新性：使用mTG, Microbial Transglutaminase进行位点特异性偶联是一种创新的方法，它允许研究者更精确地控制ADCs的设计，从而可能提高治疗效果和减少副作用。

• 优化潜力：mTG, Microbial Transglutaminase的活性和特异性可以通过蛋白质工程进行优化，以适应不同的偶联需求。

• 环境友好：使用酶作为催化剂通常被认为是一种环境友好的方法，因为它可以在水相中进行，减少了有机溶剂的使用。

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综上所述，mTG, Microbial Transglutaminase的使用为抗体偶联提供了一种高效、稳定且具有高度特异性的方法，有助于开发更安全、更有效的治疗药物。