TheWell Bioscience--3D水凝胶结构中神经元长期培养成熟的研究

【介绍】

与传统的二维（2D）培养相比，三维（3D）组织培养具有众多优势^{[1; 5]}。最大限度地减少对硬表面的接触可以改善细胞的成熟和存活，并提供一个更类似于细胞在体内所接触的环境。结合将特定的小分子引入3D水凝胶配方，并整合细胞附着位点如RGD肽，最近已经能够在体外更全面地重现越来越多的器官生态位，这有利于药物发现和功能性组织工程^[2]。虽然来自小鼠细胞外基质（ECM）的水凝胶选项如Matrigel?和Geltrex?已经成为3D组织领域的主力一段时间了，但重要的是要注意，它们是从癌细胞培养物中分离出来的，不是化学定义的，也不是无动物源的；这对于再生医学和人类3D组织建模的转化工作都是主要挑战^[3]。

在浅水凝胶涂层板表面上接种细胞是全3D培养和传统2D培养之间的一种有吸引力的折衷方案，因为它允许细胞避免接触硬表面，并可以促进细胞存活和成熟，同时仍然能够保持高度的可重复性和可扩展性。这些优势对神经培养特别有益，因为这些细胞平均来说更脆弱，需要一个通常更复杂的组织生态位，并且对调节要求更严格，以重现适当的神经功能和成熟^[4]。在这里，我们比较了在常见的成熟测定中，在厚水凝胶涂层（浅3D组织培养）上生长的广泛使用的永生化神经元细胞类型的形态、自我组织和存活情况。

【材料和方法】

神经细胞在未分化状态下的维持

B35大鼠神经母细胞瘤永生化细胞（ATCC CRL - 2754）用于在体外模拟神经元的长期成熟和存活。细胞在补充有10％FBS和青霉素/链霉素的DMEM培养基中保持活跃分裂和未分化状态，如有必要，每周进行两次完全培养基更换。当培养物达到约80％汇合时，使用胰蛋白酶 - EDTA在室温下孵育5分钟，以1:10的比例传代。平均而言，以这种方式维持的培养物可以每4天传代一次，并可以扩增超过20代，而不会失去分裂潜力，或在血清撤出后其成熟状态不会退化。

神经元在VitroGel和Matrigel上的分化和生长，用于2D厚凝胶涂层（浅3D培养）

B35神经元通过根据ATCC指南撤出血清在2D厚水凝胶涂层（浅3D封装）培养中进行分化。简而言之，为了达到功能性神经状态，B35细胞在无血清DMEM培养基中维持，在约5天内它们变得后有丝分裂和突触活性。

对于2D厚水凝胶涂层（浅3D培养），未分化的B35细胞添加在VitroGel 3D（TWG001；TheWell Bioscience。水凝胶与DMEM的比例为4:1）或Matrigel（80％Matrigel，20％在DMEM中）的顶部。两种水凝胶均在37°C下凝胶20分钟，然后用B35分化培养基（DMEM +青霉素/链霉素）灌注长达21天。

浅3D组织培养在体外21天孵育期间的表征

在将细胞接种到水凝胶上后立即撤出培养中的FBS以诱导分化。随后，细胞每周喂食两次，每次进行完全无血清培养基更换，持续三周。

神经培养的免疫细胞化学分析

为了表征培养状态、形态和存活情况，细胞在第3天、第7天、第9天和第21天固定，并对神经元特异性标记物Beta - III - Tubulin（T5076；Sigma - Aldrich）进行染色，以观察细胞对表面的附着、形态和细胞数量。细胞用驴抗小鼠AlexaFluor647（ThermoFisher）和DAPI（ThermoFisher）核染色剂进行复染。

【结果】

长期分化的神经培养物在3D培养中优先存活和自我组织

在21天的时间过程中，对分化的B35神经元培养物（约10K细胞/构建体）进行评估，以观察其细胞形态是否与典型的神经元突起、细胞存活和在厚水凝胶床内的自我组织一致，无论是VitroGel 3D还是Matrigel，它们都接种在其上。我们使用神经元特异性标记物Beta - III - Tubulin来评估培养物内的关键形态变化。

早在分化后第3天，细胞就扩散并形成神经样网络，根据细胞存活、培养扩散和形态分析，在第7天和第9天之间，VitroGel 3D和Matrigel之间的效果相当。在Matrigel垫上，一旦第9天过去，细胞培养健康和活力就会急剧下降，到第14天大多数细胞分离，神经突回缩，到第21天绝大多数细胞消失。如果生长在VitroGel 3D垫上，分化的B35神经元很早就有倾向于自我组织成3D簇（第7天），在时间过程的前两周假设为混合的2D/3D细胞培养。到第21天，这些细胞已经迁移到自组装的3D簇中，嵌入到厚水凝胶基质中，簇之间的细胞很少，但没有任何显著的细胞死亡（图1）。

图1：接种在厚水凝胶垫上的长期神经元培养的比较。细胞用Beta - III - Tubulin（绿色）细胞骨架标记物染色，其细胞核用DAPI（蓝色）复染。

长期分化的神经培养物在涂有VitroGel 3D - RGD的平板上的2D培养中存活并形成广泛的神经突起

除了2D厚凝胶涂层方法外，B35神经元也可以在2D薄凝胶涂层方法上进行分化和维持。对于2D薄凝胶涂层培养，组织培养处理的平板用VitroGel 3D - RGD（TWG002；TheWell Bioscience。1:20稀释）与DMEM在室温下混合两小时，或用Matrigel（从库存中在DMEM中1:100稀释；约80 - 120?g/ml）也在室温下混合两小时进行涂层。在两周的过程中跟踪细胞对表面的粘附表明，接种在VitroGel 3D - RGD上的细胞能够很好地粘附并在撤出胎牛血清（FBS）后以典型的神经形态扩散，这会触发B35细胞系分化为后有丝分裂神经元。在同一时间段内，也在Matrigel上进行了对照接种（图2）。总体而言，VitroGel 3D - RGD允许细胞粘附与Matrigel相当，培养物能够以类似的方式进行分化，并且在两种情况下都观察到了神经突延伸。VitroGel可以提供无动物源和化学定义的表面涂层，这将允许对培养条件进行更强的控制，并减少复杂实验中的混杂因素。

 图2：接种在薄2D水凝胶涂层上的长期神经元培养的比较。大鼠永生化B35细胞接种在VitroGel 3D - RGD或Matrigel上，通过血清撤出进行分化，并维持两周以跟踪神经突延伸和细胞附着。

【讨论】

根据我们的结果，我们推测VitroGel 3D和Matrigel都能够在相对较短的时间内支持细胞分化，目前使用B35细胞的大多数神经测定都是在这段时间内进行的。由于Matrigel的基质中由于其来源而含有生长因子和增殖/保护可溶性分子，因此在这种特定培养中可能具有轻微的优势，但在长期维持后期，这种趋势似乎会逆转，分化的B35神经元在体外第14天后从水凝胶垫上分离并漂浮。在我们的研究中，VitroGel在支持神经元长期成熟和存活方面表现出与Matrigel对照相当或更好的性能。这并不意外，因为Matrigel和实际上一般的3D培养已经被报道在传统的2D培养中提供细胞保护、增殖和成熟优势^[5]。

在我们的研究中，VitroGel 3D是一种完全化学定义和无动物源的水凝胶，细胞活力没有显著损失。这与Matrigel相比具有优势，Matrigel不是无动物源的，也不是化学定义的，因此如果用作厚涂层支持或与人类来源的神经元、心肌细胞等敏感细胞的全3D组织基质使用，可能会产生意想不到的副作用。由于其配方的性质，VitroGel没有固有的预先存在的生长因子。该系统可以通过接种可溶性因子进一步修改以重现所需的生态位，并且可以以受控、可重复和定义的方式进行，这使其非常适合用于人类疾病的无动物源模型和器官模拟开发的支架。

【参考文献】

1.Ravi M, Paramesh V, Kaviya SR, Anuradha E, Solomon PFD. 3D Cell Culture Systems: Advantages and Applications. J. Cell. Physiol. 2015; 230: 16–26.

2.Edmondson R, Broglie JJ, Adcock AF, Yang L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 2014; 12 (4): 207-218.

3.Fan Y, Wu J, Ashok P, Hsiung M, Tzanakakis ES. Production of Human Pluripotent Stem Cell Therapeutics Under Defined Xeno-free Conditions: Progress and Challenges. Stem cell reviews. 2015; 11 (1): 96-109.

4.Lu HF, Lim S-X, Leong MF, Narayanan K, Toh R, Gao S, Wan A. Efficient neuronal differentiation and maturation of human pluripotent stem cells encapsulated in 3D microfibrous scaffolds. Biomaterials. 2012; 33 (36): 9179-9187.

5.Baker BM, Chen CS. Deconstructing the third dimension – how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell. Sci. 2012; 125: 3015-3024.